甘肃省南瓜及西葫芦小西葫芦黄花叶病毒病鉴定

文朝慧， 刘雅莉

（甘肃出入境检验检疫局，兰州 730020）

小西葫芦黄花叶病毒［Zucchiniyellowmosaic virus（ZYMV）］属马铃薯Y病毒属成员，病毒粒子为弯曲线状，长750nm，直径11nm，含一条单链正义RNA。该病毒1973年首次分离于意大利［1］，主要通过蚜虫以非持久性方式高效传播［2］，能侵染葫芦科、豆科、苋科、藜科等11科植物［3］，目前在澳大利亚、法国、德国、西班牙、英国、美国、日本等广泛发生，是世界性分布和危害最严重的病毒之一。被小西葫芦黄花叶病毒侵染的葫芦科作物，叶片黄化并带有严重花叶、畸形，产量大幅度降低［4］。据Tóbiás［5］、Schrijnwerkers［6］等研究，ZYMV 可通过南瓜和笋瓜的种子进行传播。

甘肃省河西地区气候干燥，光照充足，昼夜温差大，绿洲与戈壁交错形成天然的隔离条件，病虫危害轻，是各类农作物制种的理想基地，目前该地区已发展为我国重要的对境外制种基地，其对外繁种的瓜类作物有西瓜、甜瓜、黄瓜、冬瓜、苦瓜、西葫芦、南瓜、瓠瓜、角瓜等多种。这些作物原种来自国外，繁育收获后的种子出口到美国、德国、荷兰、以色列、日本、韩国、我国台湾等30个国家或地区，因而每年出入境的南瓜、西葫芦等作物种子众多。近年来，河西地区瓜类作物病毒病害发生严重，田间发病率可达15%，但病原不清，为明确ZYMV在当地瓜类作物上的危害情况，作者对该地区南瓜［Cucurbitamoschata（Duch.）Poiret］和西葫芦（C.pepoLinn.）的田间病样和出入境种子含带小西葫芦黄花叶病毒情况进行了系统调查和鉴定，利用植物病毒的抗血清对全部样本进行了ELISA检测，对ELISA部分阳性样本进行了RT－PCR扩增、测序及序列分析。

1 材料和方法

1.1 病害调查和样本采集

1）2006－2008年每年7月，在甘肃省河西地区采集可能被病毒感染、症状明显的南瓜、西葫芦叶片及果实，分别装在不同的洁净塑料袋中，标明采集时间、地点和材料，保存于－70℃低温冰箱。

2）供试种子58份，为本实验室检测的河西地区出入境种子，检测样本为随机抽取材料。

1.2 主要试剂

ZYMV酶联免疫吸附检测试剂盒购自美国Agdia公司；Trizol购自Invitrogen公司；M－MLV反转录酶、RNase抑制剂、TaqDNA 聚合酶、dNTP、100bp ladder DNA marker购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；其他化学试剂为国产分析纯。

1.3 DAS－ELISA检测

采用碱性磷酸酯酶标记双抗体夹心法（DASELISA）对全部样本进行血清学检测，具体检测步骤参照提供抗体的公司产品说明书。以健康植株／种子为阴性对照，样品A值／阴性对照A值大于2为阳性反应，A值利用 MUTISKAN型Thermo labsystems酶标仪在405nm波长下测定。

1.4 RT－PCR扩增和测序分析

1.4.1 引物合成

根据GenBank已报道的ZYMV病毒基因组保守序列，设计并合成寡核苷酸引物。p1：5′－ATGCAGAGGCACCATACAT－3′；p2：5′－TACTGCATTGTGTTCACACC－3′［7］。预 期 扩 增 产 物 大 小 为283bp。

1.4.2 植物组织总RNA的提取

1）田间病样以Trizol法提取。称取0.1g植物叶片倒在洁净的研钵内，加液氮研细，移入1.5mL离心管中（DEPC处理），加入1mL的Trizol，剧烈振荡3min以上；4℃下，12 000r／min离心10min以除去不溶成分，将上清转入另一新的1.5mL离心管中；加0.2mL氯仿，振荡混匀15min，然后在室温下静置2～15min，再于4℃、12 000r／min离心15min；将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀；室温静置15min；4℃、12 000r／min离心10min，弃上清，加入75%乙醇洗涤沉淀，然后4℃、7 500r／min离心5min，弃乙醇；室温晾干5～10min，加入30μL DEPC处理的超纯水溶解，－70℃保存备用。

2）种子样本以SDS－酚氯仿法提取［8］。称取2.5g种子放入预冷的研钵内，加液氮研磨成粉末状，将粉末转入15mL预冷的离心管中，加入6mL RNA抽提缓冲液（50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0；10mmol／L EDTA，pH 8.0；140mmol／L NaCl；1%SDS；2%PVP）及等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），振荡均匀，冰浴10min；4℃、12 000r／min离心15min；取上清液，加等体积氯仿：异戊醇（24∶1）、1／4体积无水乙醇、1／10体积5mol／L乙酸钾，振荡均匀，冰浴10min；4℃、12 000r／min离心15min；将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，以异丙醇沉淀RNA，其余步骤同1）。

1.4.3 RT－PCR反应

cDNA第1链的合成：以1μL总RNA为模板，加入1μL dNTP（10mmol／L）、10μL DEPC 水、2μL p2，70℃保温5min后，冰上放置2min，再加入4μL 5×反转录buffer、1μL RNAsin（40U／μL）、1μL M－MLV（200U／μL），37℃反应40min。

PCR：以合成的cDNA第1链为模板进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后一轮循环后在72℃延伸10min。取10μL PCR产物经1.0%琼脂糖电泳，凝胶成像仪分析并记录结果。

1.4.4 序列测定和序列相似性比较

RT－PCR产物用UNIQ－10柱式PCR纯化试剂盒（Sangon）纯化后，直接用于测序，序列测定在ABI 3730XL DNA测序仪上完成（委托TaKaRa公司进行）。测序结果通过BLASTn与GenBank中目标核苷酸序列进行相似性比较。

2 结果与分析

2.1 南瓜和西葫芦ZYMV病毒病的症状

在田间病害调查中发现，瓜类作物受病毒病侵染后，常常表现为系统花叶，病叶出现斑驳、疱斑、皱缩（封面a），病果实表面斑驳、有瘤状突起、果形扭曲等（封面b），仅根据田间症状难以确定所感染的病毒种类。

结合实验室检测结果发现，受ZYMV侵害后，发病初期西葫芦叶片出现局部褪绿斑、明脉，后表现叶片花叶，新叶上有疱斑甚至发生严重的蕨叶现象（封面c），而南瓜病叶的症状与西葫芦的相似。

2.2 DAS－ELISA检测结果

在南瓜和西葫芦田间病样中均检测出ZYMV，其中10个南瓜显症叶片样本中有5个感染ZYMV，9个西葫芦显症叶片样本中有3个感染ZYMV。在24份南瓜种子中有3份检出ZYMV，分别为来自我国台湾、荷兰和以色列，种子带毒批次占12.5%；在34份西葫芦种子中有4份检出ZYMV，其中3份占从美国、韩国、哥斯达黎加进境的种子，1份为出境的种子，种子带毒批次占11.8%。

2.3 RT－PCR扩增及序列分析

RT－PCR扩增结束后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳显示（图1），ZYMV阳性样品扩增出约280bp的条带，片段大小与预期结果一致，且无非特异性片段的产生；阴性对照和空白对照均未出现相应条带。

经序列测定和序列相似性比较，该扩增产物核苷酸序列与世界各地的ZYMV分离物CP基因相似性大于93%，证明该DNA片段为ZYMV的部分序列。

图1 RT－PCR扩增结果

3 讨论

小西葫芦黄花叶病毒自1991年在国内首次报道发生以来［9］，在河南、陕西、河北、山西、北京、广州、浙江杭州和广西等地的葫芦科作物上相继发现危害，已成为我国葫芦科作物的主要病原［10］。目前ZYMV虽然不属于检疫对象，但其在多个国家和地区发生流行，危害严重，2006－2008年笔者已数次在出入境种子中检测到该病毒，ZYMV在甘肃河西地区除侵染南瓜和西葫芦外，也危害黄瓜、西瓜和甜瓜等其他瓜类作物（待发表）。在调查和检测中发现，河西地区瓜类作物病毒病的病原还有黄瓜花叶病毒（CMV）和黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV），从检出频率看ZYMV是侵染甘肃瓜类作物的重要病毒种类。

Heather对ZYMV的进化研究表明，人为传播在ZYMV的世界性传播蔓延中起重要作用［11］。Fletcher的田间试验表明，作物早期及中期感染ZYMV将造成产量的严重损失［12］。在作者的检测中，西葫芦种子带毒批次占11.8%，南瓜种子带毒批次占12.5%，证实ZYMV可随南瓜和西葫芦带毒种子的调运而传播蔓延，如果播种带病种子，长出的幼苗发病后，就形成田间初侵染源，加之河西地区夏季高温干旱，蚜虫发生量大，很容易造成瓜类作物病毒病的发生流行，因此加强种子检疫、种植无毒种子是防治该病毒病的重要措施。

ZYMV的常规检测手段包括生物学检测、电镜观察及免疫学方法等，分子检测技术大多以感染ZYMV的植株叶片为检测材料，笔者除检测田间显示症状的叶片外，还直接对西葫芦和南瓜干种子进行了检测。鉴于种子带毒的不均匀性，在用RTPCR方法检测种子中的ZYMV时，对一份样品需要设置多个重复，以提高诊断结果的准确性。本研究采用DAS－ELISA和RT－PCR相结合的方法，鉴定了引起甘肃河西地区南瓜及西葫芦病毒病的小西葫芦黄花叶病毒，分析了田间发生和种子带毒情况，建立了切实有效的检测体系与方法，为该病害的防控提供了科学依据。

［1］Lisa V，Boccardo G，D’Agostino G，et al.Characterization of apotyvirus that causes zucchini yellow mosaic［J］.Phytopathology，1981，71：667－672.

［2］赵荣乐，郑光宇.桃蚜可高效率地传播小西葫芦黄化花叶病毒新疆株［J］.北京师范大学学报（自然科学版），2003，39（3）：98－101.

［3］陈洁云，陈集双，柴立红，等.侵染南瓜的小西葫芦黄化花叶病毒的分离与鉴定［J］.浙江大学学报（农业与生命科学版），2003，29（5）：539－544.

［4］陈洁云，陈集双，柴立红，等.两种葫芦科病毒的分子检测和致病性研究［J］.植物病理学报，2003，33（5）：449－455.

［5］Tóbiás I，SzabóB，Salánki K，et al.Seedborne transmission ofZucchiniyellowmosaicvirusandCucumbermosaicvirusin Styrian Hulless group ofCucurbitapepo［C］∥Cucurbitaceae 2008，Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae，Avignon（France），May 21－24th，2008：189－198.

［6］Schrijnwerkers C C F M，Huijberts N，Bos L.Zucchiniyellow mosaicvirus：two outbreaks in the Netherlands and seed transmissibility［J］.Eur J Plant Pathol 97，1991：187－191.

［7］张永江.一步法RT－PCR检测小西葫芦黄花叶病毒［J］.植物检疫，2005，19（3）：141－142.

［8］王杰，王晓鸣，黄丽丽.大豆干种子中大豆花叶病毒的RT－PCR检测［J］.植物病理学报，2005，35（3）：214－220.

［9］郑光宇，董涛.在新疆发生的小西葫芦黄化花叶病毒研究初报［J］.植物病理学报，1991，21（1）：72.

［10］古勤生，Piero Roggero，Marina Ciuffo，et al.我国北方地区葫芦科作物病毒病的调查与病原鉴定［J］.云南农业大学学报，2003，18（4）：88－89.

［11］Heather E S，Edward C H，Andrew G S.Rapid evolutionary dynamics ofZucchiniyellowmosaicvirus［J］.J Gen Virol，2008，89：1081－1085.

［12］Fletcher J D，Wallace A R.Potyviruses in New Zealand buttercup squash （CucurbitamaximaDuch.）：yield and quality effects of ZYMV and WMV 2virus infections［J］.New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，2000，28（1）：17－26.