ATP对髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道的调节

张成标，杨 雷，谷瑞民

(1.徐州医学院麻醉学重点实验室，江苏徐州 221002;2.哈尔滨医科大学药理学教研室，黑龙江哈尔滨 150086)

肾脏髓袢升支粗段(thick ascending limb of henle’s loop)对NaCl的主动重吸收，启动了髓质渗透梯度建立，在尿液的浓缩和稀释中发挥重要作用。髓袢升支粗段对NaCl主动转运的动力来自上皮细胞管周膜上的钠－钾泵，而管周膜上的钾通道也参与了NaCl的主动转运过程。由于钾通道的活性受多种内源性活性物质或药物的影响［1－2］，而钠－钾泵活动必然引起细胞内ATP浓度发生变化，因此，ATP对管周膜钾通道是否有调节作用值得探讨。髓袢升支粗段管周膜存在多种不同电导的钾通道，其中50 pS钾通道数量最多，提示其可能在NaCl的主动转运中起重要作用。本实验利用单通道膜片钳技术，观察ATP对髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道活动的影响，进一步阐明髓袢升支粗段对NaCl的重吸收机制，为开发新的高效、安全利尿药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 肾小管的分离 健康SD(Sprague-Dawley)大鼠，体质量70～100 g，♀♂不限。由哈尔滨医科大学第二临床学院实验动物中心提供。大鼠在颈关节脱位后，立即打开腹腔取出肾脏，去除包膜，从肾脏的中间部分用刀片切出厚0.5～1 mm的冠状切片，浸入浓度为1 g·L－1胶原酶溶液，放进37℃恒温水浴箱中消化45～60 min。在体视显微镜下分离出肾小管髓袢升支粗段，放在涂有多聚赖氨酸的载玻片(5 mm×5 mm)上固定并移送至膜片钳系统的细胞记录槽中。

1.2 膜片钳单通道记录 用PP-830型微电极拉制仪(Narishige，日本)两步拉制玻璃微电极，微电极尖端的直径约为0.5～1.0 μm，拉制完成后再适度抛光。在内充电极内液时，电极的入液电阻为20～50 MΩ。

选取清洁、光滑、完整、结构清晰的肾小管进行膜片钳实验。本实验主要采用细胞贴附式(cell-attached)和内面向外式(inside-out)两种单通道电流记录方法。对经胶原酶消化过的髓袢升支粗段肾小管的管周膜进行封接，形成高阻封接后即形成细胞贴附式记录模式。在细胞贴附式记录模式下，向上提起玻璃微电极出液面后再入液即形成内面向外式记录模式。

实验使用的膜片钳系统Axopatch200B膜片钳放大器、Digidata 1322模－数转换器、记录和分析软件为pCLAMP 9.2(Axon公司，美国)。采样频率为10 kHz，滤波频率为0.2 kHz。用通道总开放概率NP0作为衡量通道活性大小的指标，它是单个通道开放概率(open probability，P0)与通道开放数(N)的乘积，其数值可用公式NP0=Σ(1×t1+2×t2+…+i×ti)计算。公式中的i表示通道开放的电流水平，在该水平有i个通道同时开放;ti表示通道在该水平开放的持续时间占总时间的分数。

1.3 实验溶液及药品 电极内液(mmol·L－1):KCl 140，MgCl21.8，HEPES 10(pH=7.4)。浴液(mmol·L－1):NaCl 140，KCl 5，CaCl21.8，MgCl21.8，HEPES 10(pH=7.4)。胶原酶(Collagenase type IA，购于Sigma公司)溶液在每次实验时临时配制，每次称取1～2 mg，用浴液稀释成浓度为1g·L－1的酶溶液。ATP(购于Sigma公司)先用浴液配制成一定浓度的母液冻存或置于0～4℃备用，实验时用微量加样器抽取一定量的药液加入细胞记录槽，使浴槽中的药物浓度达到实验要求。

1.4 剂量-效应关系 在形成内面向外式记录模式后，每隔5 min依次向浴槽内加入一定量的ATP母液，使浴液中的ATP浓度分别达到0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L－1，观察不同浓度的 ATP 对50 pS钾通道活动的影响，并绘制剂量反应曲线。

2 结果

2.1 记录通道类型及电导大小的确定 实验中记录到的单通道电流能被钾通道阻断剂Ba2+阻断(Fig 1)，证明其是钾通道。该通道的单通道电流大小随着钳制电压的变化而变化，以电压为横坐标、电流为纵坐标可作出电流－电压(I-U)曲线(Fig 2)，根据曲线斜率计算出通道电导约为50 pS。在髓袢升支粗段管周膜记录到的单通道电流中，50 pS钾通道电流出现的频率最大，约占钾通道电流总数的75%。

Fig 1 The effect of 1mmol·L-1Ba2+(BaCl2was added to the bath solution)on channel activity in an inside-out patch Holding potential was 0 mV;C:channel-closed level

Fig 2 Current(I)-voltage(U)curve of 50 pS K+channel obtained from a cell-attached patch

2.2 ATP对髓袢升支粗段50 pS钾通道活性的影响

2.2.1 在细胞贴附式(cell-attached)膜片钳记录模式下，ATP对50 pS钾通道活性的影响 在钳制电压为0 mV时，形成细胞贴附式封接并记录50 pS钾通道电流，记录3～5 min后向浴槽内加入一定量的ATP母液，使浴液中的ATP浓度达到1.0 mmol·L－1。加药前后50 pS钾通道的开放概率分别为0.42±0.21和0.38±0.20，两者差异无显著性(n=8，P＞0.05)。Fig 3是一例典型的膜片钳记录，显示在细胞贴附式膜片钳模式下，1.0 mmol·L－1ATP对50 pS钾通道活性无影响。

2.2.2 在内面向外式(inside-out)记录模式下，ATP对50 pS钾通道活性的影响 在细胞贴附式记录模式下，提起玻璃微电极出液面后再入液，即可形成内面向外式单通道电流记录模式。先记录3～5 min，然后向浴槽内加入ATP使其浓度达到1.0 mmol·L－1，结果该浓度的ATP抑制了50 pS钾通道的开放，NPo从加药前的0.46±0.28降低到0.02±0.04(n=8，P＜0.01)，将 ATP洗脱后 NPo恢复到0.41±0.25。Fig 4是一例典型的内面向外式单通道记录，显示1.0 mmol·L－1ATP对50 pS钾通道具有可逆性抑制效应。

剂量反应曲线表明，ATP对50 pS钾通道的抑制作用与其浓度正相关(Fig 5)。

Fig 3 Effect of 1 mmol·L-1ATP on the activity of the basolateral 50 pS K+channel in the TAL of rat kidney in cell-attached patches

Fig 4 Effect of 1 mmol·L-1ATP on the activity of the basolateral 50 pS K+channel in the TAL of rat kidney in inside-out patches

Fig 5 The dose-response curve of the ATP effect on the basolateral 50 pS K+channels in inside-out patches

3 讨论

肾脏髓袢升支粗段对Na+和Cl－的主动重吸收是髓质渗透梯度建立的直接动力，在尿液的浓缩和稀释方面发挥重要作用。这种作用与髓袢升支粗段的特殊结构有关，该段肾小管上皮细胞的管腔膜存在Na+-2Cl－-K+同向转运体，而管周膜上有钠－钾泵和氯通道，Na+-2Cl－-K+转运体将小管液中的Na+、K+和Cl－转运至细胞内，钠－钾泵和氯通道再将细胞内Na+和Cl－转运至组织间液。髓袢升支粗段上皮细胞的管周膜和管腔膜上均存在钾通道，这些通道在NaCl的主动转运过程中也发挥重要作用，因为钾通道将进入细胞内的K+(通过Na+-2Cl－-K+同向转运体和钠－钾泵)即时地转运至细胞外，维持了上述转运过程的正常进行。因此，管周膜上的钠－钾泵与钾通道在功能上是偶联的。细胞内ATP含量的变化可能是将二者联系起来的关键因素，因为钠－钾泵活动会引起细胞内ATP浓度发生变化，而钾通道家族中存在ATP敏感钾通道。除了ATP以外，腺苷也可能是将钠－钾泵与钾通道活动偶联起来的关键物质，因为钠－钾泵活动的增强或减弱不仅引起细胞内ATP消耗增多或减少，也使经ATP分解代谢途径生成的腺苷发生相应的变化，而腺苷对髓袢升支粗段管周膜钾通道有激活作用［5］。但腺苷对管周膜钾通道的激活作用只发生在高浓度(1 μmol以上)的情况下，生理浓度(50～200 nmol·L－1)的腺苷对髓袢升支粗段管周膜钾通道并无激活作用［3－4］，提示在生理条件下，腺苷并不参与管周膜钾通道活动的调控，可能在某些病理生理条件下(如缺血、缺氧等)，组织细胞释放大量腺苷时才影响钾通道的功能。我们在髓袢升支粗段管周膜膜片钳实验中记录到最多的是50 pS钾通道，这与文献报道［5－6］一致，提示50 pS钾通道具有重要功能。本实验显示，在内面向外式记录模式下，1 mmol·L－1的ATP几乎完全阻断了髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道的开放，而在细胞贴附模式下，同样浓度的ATP对50 pS钾通道的活性无明显影响。剂量反应曲线表明，在内面向外式记录模式下，ATP对髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道的抑制作用具有剂量依赖性。这些结果说明，细胞内ATP含量的变化是调节50 pS钾通道活性的重要因素。ATP敏感性钾通道广泛存在于肌肉、神经、腺垂体等可兴奋性组织以及肾小管上皮、卵泡的卵母细胞等非兴奋性组织［7－8］，受细胞内 ATP 浓度的调控，因此，髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道可能是一种ATP敏感性钾通道。在基础条件下，细胞内ATP的浓度约为3～5 mmol·L－1，但在进行某些耗能活动时(如物质跨膜转运)，细胞内的 ATP浓度可降至1 mmol·L－1以下［9］，在内面向外式记录模式下，1 mmol·L－1的ATP几乎完全抑制50 pS钾通道的开放，表明在基础条件下，髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道可能受到高浓度ATP的抑制而处于关闭状态，但当NaCl的主动重吸收明显增强时，细胞内ATP浓度降低，对50 pS钾通道的抑制作用减弱，钾通道开放概率逐渐增加，从而将因钠－钾泵活动增强而涌入细胞内的K+及时地转移至细胞外(组织间液)，维持细胞内外正常的K+浓度梯度和正常的膜电位水平，使髓袢升支粗段对NaCl的主动重吸收能持续地进行。因此，髓袢升支粗段管周膜50 pS钾通道受细胞内ATP调控，这种调控作用的意义可能是把钾通道和钠－钾泵在功能上联系起来。

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