嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比研究

张华军,徐格林,刘新峰#

1.南京大学医学院附属鼓楼医院中西医结合科,南京 210008;2.南京军区南京总医院神经内科,南京210002

神经元是中枢神经系统(central nervous system,CNS)基本结构单位,神经胶质细胞作为另一种细胞类型,在神经元的生长发育和修复过程中发挥重要作用。星形胶质细胞(astrocytes,ACs)是哺乳动物CNS内分布最广泛的胶质细胞之一,主要功能是为神经元提供营养和能量物质,促进神经元生长、发育和修复。ACs可通过分泌可溶性因子介导神经保护功能[1-3]。

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是存在于嗅觉系统的特殊类型胶质细胞,可促进成年哺乳动物嗅感觉神经元不断更新,促进多种CNS神经元存活和轴突生长[4-6]。OECs这些功能部分源于OECs分泌的多种营养物质[7-9]。

本研究分别采用嗅鞘细胞条件培养液(olfactory ensheathing cells conditioned medium,OECCM)和星形胶质细胞条件培养液(astrocytes conditioned medium,ACM)预处理受损的海马神经元,对比2种条件培养液对受损海马神经元活力、凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度的影响,旨在从胶质细胞分泌的角度研究嗅鞘细胞和星形胶质细胞对受损海马神经元的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:成年 SD大鼠 80只,雌雄不限,体质量 180～220 g,出生 24 h内的SD大鼠80只,雌雄不限,由南京军区总院实验动物中心提供。②主要试剂与材料:DMEM/F12培养基、胎牛血清、Neurobasal培养基、50×B27添加剂(购于Gibco公司);四氮甲唑蓝(M TT)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)和Fluo-3/AM(购于Sigma公司);磷脂结合蛋白Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(购于Biovision公司);胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)(购于Chemicon公司);截留分子量为5KD的超滤离心管(购于Millipore公司);兔抗神经生长因子低亲和力受体(low affinity nerve grow th factor receptor,p75NTR)抗体(购于Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 嗅鞘细胞培养与鉴定 成年健康SD大鼠,常规消毒,无菌环境下迅速完整取出双侧嗅球,解剖显微镜下轻轻剥去嗅球外包被的血管膜,分离出外2层(嗅神经层及颗粒层)置于冰浴解剖液中,剪碎组织块,加入胰酶消化。加入等体积的含胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化,轻轻吹打,制成细胞悬液,按细胞密度为1×106/mL接种于无菌培养瓶中,移入37℃、5%CO2培养箱中培养。差速贴壁法[10]纯化嗅鞘细胞,培养10 d,经p75NTR和DAPI免疫细胞化学双染,鉴定嗅鞘细胞纯度。

1.2.2 海马星形胶质细胞培养与鉴定 取成年健康SD大鼠,参照Lin等[2]的方法培养星形胶质细胞10 d,经GFAP和DAPI免疫细胞化学双染鉴定星形胶质细胞纯度。

1.2.3 海马神经元的培养和谷氨酸损伤模型制作 取出生 24 h内的SD大鼠,参照Brewer等[11]的方法,采用海马专用无血清培养基(添加B27的Neurobasal培养基)培养海马神经元,取培养7 d的细胞,经NSE和DAPI免疫细胞化学双染鉴定神经元。根据本课题组预试验结果,选取0.5 mM 的谷氨酸浓度制作神经元损伤模型。

1.2.4 ACM和OECCM的收集和浓缩ACM和OECCM的收集均取自生长状态良好、培养第10天的嗅鞘细胞和星形胶质细胞,按照1×106/mL重新接种细胞,经12 h细胞贴壁后,Hanks液清洗2次,加入添加B27的Neurobasal培养基3 mL培养48 h,收集上清液,-80℃保存。收集完毕后,统一采用超滤离心管,低温离心,浓缩OECCM和ACM,-80℃保存。

1.2.5 分组 ①正常组:培养第8天的海马神经元经Hanks液清洗2次后,换为海马专用无血清培养基培养24 h。②谷氨酸组:培养第8天的海马神经元用终浓度为0.5 mM的谷氨酸作用0.5 h后,换为海马专用无血清培养基培养23.5 h。③OECCM 组:培养第7.5天的海马神经元用OECCM预先孵育12 h,加入终浓度为0.5 mM的谷氨酸作用0.5 h,Hanks液清洗2次,换为海马专用无血清培养基培养23.5 h。④ACM 组:培养第7.5天的海马神经元用ACM预先孵育12 h,加入终浓度为0.5 mM的谷氨酸作用0.5 h,Hanks液清洗2次,换为海马专用无血清培养基培养23.5 h。

1.2.6 海马神经元活力检测 预先接种在96孔板中的海马神经元,经以上干预后,每孔加入MTT溶液20 μ L,37℃继续孵育4 h,弃孔内培养液,每孔加 DMSO 150 μ L,震荡10 min,上酶标仪,选择490 nm波长测各孔OD值。每组取5个样本,重复检测3次。检测得到的OD值与细胞活力呈正相关。

1.2.7 Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测凋亡率 消化以上各组海马神经元,调整细胞密度到1×106/mL,移入无菌离心管中,1500 rpm 离心5 min,弃上清;用0.01 M PBS 1 mL洗涤离心,弃上清;再次加入500 μ L缓冲液,振荡后,加入Annexin-V和PI溶液各2 μ L,避光,孵育10 min,上流式细胞仪检测。每组取5个样本,重复检测3次。

1.2.8 神经元胞浆内游离钙离子浓度检测消化各组海马神经元,将细胞密度调整到1×106/mL,移入无菌离心管中,1500 rpm离心5 min,弃上清;加入含钙镁的PBS液和终浓度为 5 mmol/L的 Fluo-3/AM,避光37℃,5%CO2孵育30 min,洗涤离心,弃上清;再次加入含钙镁的 PBS缓冲液500 μ L振荡后,上机检测。另设2组细胞悬液,1组加入荧光淬灭剂M nCL2,检测结果为Fmin;1组加入CaCL2,检测结果为Fmax。按下列公式计算细胞内游离钙离子浓度:[Ca2+]i=Kd×[(F-Fmin)/(Fmax-F)]。Kd=450 nmol/L,为Fluo-3与Ca2+的解离常数,以nmol/L为单位表示。每组取5个样本,重复检测3次[12-14]。

2 结果

2.1 培养细胞纯度鉴定结果 培养的嗅鞘细胞、海马星形胶质细胞及神经元纯度均达到95%。

2.2 海马神经元活力测定结果 与正常组相比,OECCM组神经元活力降低(P＜0.05),谷氨酸组、ACM组神经元活力均明显降低(P＜0.01);与谷氨酸组相比,OECCM组神经元活力明显增高(P＜0.01),ACM组神经元活力增高(P＜0.05);与OECCM组相比,ACM组神经元活力降低(P＜0.05),见图 1。

图1 不同条件培养液对海马神经元活力的影响 与正常组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与谷氨酸组比较,△P＜0.05,△△P＜0.01;与OECCM组比较,#P＜0.05

2.3 神经元凋亡检测结果 与正常组相比,OECCM组神经元的凋亡率升高(P＜0.05),谷氨酸组、ACM组神经元的凋亡率明显升高(P＜0.01);与谷氨酸组相比,ACM组神经元的凋亡率降低(P＜0.05),OECCM组明显降低(P＜0.01);OECCM组神经元的凋亡率低于ACM 组(P＜0.05),见表1。

2.4 细胞内游离钙离子浓度检测结果 与正常组相比,OECCM组神经元的胞内游离钙离子浓度升高(P＜0.05),谷氨酸组、ACM组神经元的胞内游离钙离子浓度明显升高(P＜0.01);与谷氨酸组相比,ACM组的胞内游离钙离子浓度降低(P＜0.05),OECCM组神经元的胞内游离钙离子浓度明显降低(P＜0.01);OECCM组神经元的胞内游离钙浓度低于ACM 组(P＜0.05),见表1。

表1 不同条件培养液对海马神经元的凋亡率和胞内游离钙离子浓度的影响(±s)

表1 不同条件培养液对海马神经元的凋亡率和胞内游离钙离子浓度的影响(±s)

与正常组比较,①P＜0.05,②P＜0.01;与谷氨酸组比较,③P＜0.05,④P＜0.01;与OECCM 组比较,⑤P＜0.05

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3 讨论

神经元的生长发育受各种因子调节,多种神经营养因子对受损神经元起保护作用,如神经生长因子(nerve grow th factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、胰岛素样生长因子等。尽管胶质细胞条件培养液中成分不十分明确,但研究发现胶质细胞分泌的可溶性因子介导神经保护作用。作为2种不同的胶质细胞,研究证实嗅鞘细胞和星形胶质细胞均通过分泌方式发挥神经保护作用。

本研究通过对细胞活力、神经元凋亡率和细胞内游离钙离子浓度的研究发现:2种胶质细胞培养液中存在活性成分,可以减轻谷氨酸对神经元的损伤,延缓其损伤发展,保护受损神经细胞;与ACM相比,OECCM的神经保护作用更佳。Feng等[15]研究发现:6-羟基多巴胺致PC12细胞的凋亡可被OECCM阻断,可能是OECCM通过上调Bcl-2,下调Bax的通路发挥作用。近期研究发现OECCM刺激海马神经元的存活、并提高轴突密度,并发现OECCM作为神经因子的来源与添加胶质细胞源性神经营养因子和NGF等有所不同[16]。以上结果也证实本研究的结论,即嗅鞘细胞分泌的因子在神经功能修复和神经重塑方面具有优势。

目前有许多OECCM和ACM神经保护作用的报道[1-3,7-9,17-19],但关于嗅鞘细胞和星形胶质细胞对神经元保护作用的对比研究尚未见报道,本研究有助于进一步评价不同胶质细胞通过外分泌产生的神经保护作用。本研究认为OECCM可能分泌更适合神经元存活的物质,结合前期的研究发现[20-21],本课题组将会进行进一步的研究,以明确ACM和OECCM中的具体营养成分,以及产生这种差别的原因。推测ACM和OECCM神经保护的原因可能通过促进神经元内钙结合蛋白Calbindin-D28k的表达而拮抗钙超载。Lin等[2]的研究发现星形胶质细胞对于缺血脑细胞的保护作用不仅依赖于星形胶质细胞释放的各种因子,而且与受损细胞表面受体的变化相关,如缺血神经元表面的神经营养因子-3受体增加,缺血星形胶质细胞的胶质细胞源性神经营养因子受体增加。这些研究结果也提供新思路,即细胞表面受体的变化是否也会影响神经保护作用,同时也有助于进一步开展对胶质细胞的神经保护研究。

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