慢性乙型肝炎患者HBV基因型和亚型分布调查

殷继明 金荣华 严 艳 孙焕琴 于洪波 王 锋 孙殿兴 冯常炜 魏少峰 李 卓

根据乙型肝炎病毒（HBV）全基因组序列异质性≥8%或S 基因序列≥4%，已将HBV 分为A～H 8个基因型。不同基因型又可进一步分为不同亚型，现有研究表明，我国流行的HBV 基因型主要为B 基因型和C 基因型，其中北方以C 型为主，南方以B 型为主。不同基因亚型在我国的流行情况如何，是否与临床疾病进展有关还需要进一步探讨。本研究应用基因型和基因亚型特异性引物聚合酶链反应法扩增HBV DNA，根据扩增片断的大小判断HBV 基因型和基因亚型，对我国部分城市660 份慢性乙型肝炎患者血清进行了HBV 基因型和基因亚型检测。

材料与方法

一、血清标本 采集660 例慢性乙型肝炎患者血清，其中北京474 例、长春55 例、大连20 例、西安26例、石家庄40 例、郑州33 例、合肥12 例。全部血清标本均为HBV DNA 阳性。临床诊断参照2005年慢性乙型肝炎防治指南的标准[5]。

二、血清学检测 采用ELISA 法检测乙型肝炎血清标记物（北京万泰生物药业有限公司）；采用实时荧光定量PCR 法检测血清HBV DNA（杭州博赛基因诊断技术有限公司）。

三、HBV DNA 基因型和基因亚型的检测 Taq DNA 聚合酶、dNTPs 及 DNA Marker 购自北京鼎国生物技术发展中心。参照文献[6，7]并结合我国已经发表的B和C 基因型的序列设计引物，检测HBV 基因型和基因亚型，引物序列见表1 和表2，引物由上海生物工程有限公司合成。将50μL 血清加入到50μL 裂解液中，混匀，99℃水浴 10min，13000rpm 离心 10min，取上清液作为第1 次PCR 反应的模板。采用基因型特异性多对引物巢式PCR 法检测HBV 基因型。第1 次PCR 以HBV DNA 为模板，反应参数为：95℃ 10min 预变性，94℃20s，55℃ 20s，72℃ 30s，40 个循环，再 72℃ 7min；第 2次PCR 分2 组进行，先按表1 分成A 组（包括A、B、C基因型）和B 组（包括D、E、F 基因型）加引物，再分别加入第 1 次 PCR 产物 2μL，PCR 反应参数为：95℃ 10min预变性，以 94℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 30s，进行 20 个循环之后，再以 94℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，进行 20 个循环。分别取A 组和B 组扩增产物4μL 于60g/L 聚丙烯酰胺凝胶上电泳、EB 染色、观察。

表1 巢式PCR检测HBV基因型特异性引物序列

表2 检测HBV B、C 基因亚型的引物序列

采用亚型特异性引物半巢式PCR 法检测B 基因亚型。第 1 次 PCR 引物为 BAHBF 和 HBAS-4V 或BJHBF 和 HBAS-4V，以 HBV DNA 为模板，反应参数为：95℃ 5min 预变性，94℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 45s，40 个循环，72℃ 7min 延伸。取第1 次PCR 产物作为第2 次PCR 反应的模板，引物为BAHBF 和BJA-RV或BJHBF 和BJA-RV，反应参数为：95℃ 5min 预变性，94℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 30s，40 个循环，72℃7min 延伸。取第 2 次 PCR 扩增产物 10μL 于 60g/L 聚丙烯酰胺凝胶上电泳、EB 染色、观察，出现扩增产物即可判断为其中一个基因亚型。采用多对引物PCR法检测C 基因亚型。引物为HBVC1R、HBVC2R 和HBVC，以HBV DNA 作为模板，反应参数为：95℃5min 预变性，94℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 30s，40 个循环，72℃ 7min 延伸。取PCR 扩增产物10μL 于60g/L聚丙烯酰胺凝胶上电泳、染色、观察。

四、统计学分析 应用SPSS10.0 统计学软件进行x2检验和方差分析，以P＜0.05 为有统计学意义。

结 果

一、HBV 基因型和基因亚型情况 以特异性条带分型，B 基因型为 281bp，C 基因型为 122bp。本组未观察到A、E、F 基因型的特异性条带；Ba 和Bj 亚型均为110bp，C1 亚型为 340bp，C2 亚型为 240bp。在 660 份HBV DNA 阳性血清中，C 基因型为 492 例（74.54%），B 基因型为 110 例（16.67%），B 基因型和 C 基因型混合感染者 58 例（8.79%，表3）；在 492 例 C 基因型病例中，C1 亚型为 6 例（1.22%），C2 亚型为 473 例（96.14%），C1/C2 混合亚型 13 例（2.64%）。在 110 例 B 基因型病例中，均为Ba 亚型。

表3 不同地区HBV 基因型的分布

二、HBeAg 阳性和阴性慢性乙型肝炎患者HBV基因型和亚型的感染情况 在HBeAg 阳性组和阴性组 B 型、C 型、B/C 混合型的病例数分别为 72、340、33例和38、152、25 例，两组间基因型分布差异无统计学意义（x2=3.754，P=0.153）。72 例 HBeAg 阳性的 B 基因型慢性乙型肝炎患者均为Ba 亚型；38 例HBeAg 阴性的B 基因型慢性乙型肝炎患者亦为Ba 亚型。在340例HBeAg 阳性的C 基因型慢性乙型肝炎患者中，3 例（0.88%）为 C1 亚型，325 例（95.59%）为 C2 亚型，12例（3.53%）为C1 和C2 亚型混合感染；在 152 例HBeAg 阴性的C 基因型慢性乙型肝炎患者中，3 例（1.97%）为 C1 亚型，148 例（97.37%）为 C2 亚型，1 例（0.66%）为C1 和C2 亚型混合感染。在33 例HBeAg 阳性的B 基因型和C 基因型混合感染的慢性乙型肝炎患者为Ba 和C2 亚型混合感染；在25 例HBeAg 阴性的B 基因型和C 基因型慢性乙型肝炎患者为Ba 和C2 亚型混合感染。

三、不同HBV 基因型感染者血清HBV DNA 水平比较 在660 例慢性乙型肝炎患者中，B 基因型和C 基因型患者血清HBV DNA 水平分别为6.29±1.76 lg copies/ml 和 6.37±1.62 lg copies/ml，差异无统计学意义，但都高于B、C 基因型混合感染患者（5.25±1.65 lg copies/ml），其差异均有统计学意义（P＜0.05）。

讨 论

随着HBV 基因分型方法的建立和完善，大量的研究认为HBV 基因型与慢性乙型肝炎临床表现有关。近年来，在HBV 基因型研究的基础上，学者们又进行了基因亚型的研究。关于基因亚型感染的临床意义，在B 亚型较为明确，即Ba 亚型感染者的平均年龄小于Bj 亚型，HBeAg 阳性率高于Bj 亚型，但在无症状HBsAg 携带者、慢性乙型肝炎、肝硬化中所占比例以及两者转氨酶水平均无显著性差异[7]。有关不同C 基因亚型感染的临床差异，目前尚不清楚。

本研究表明我国HBV 基因型以B 基因型和C 基因型为主，其中北方地区C 基因型居多，南方地区B基因型为主，有部分B 基因型和C 基因型混合感染。HBV 基因型与病毒复制水平及病毒标志物的表达有一定的相关性。研究发现，B 基因型感染者抗-HBe 阳性率比C 基因型高，而HBV DNA 水平在B 基因型和C 基因型之间的差异无统计学意义[8，9]。但有文献报道认为，HBeAg 和抗-HBe 与HBV 基因型之间无相关性[10]。本研究结果显示，不同HBV 基因型感染患者HBeAg 阳性率差异无统计学意义，而血清HBV DNA水平有统计学差异，B 基因型和C 基因型患者之间血清HBV DNA 水平差异无统计学意义，但均高于B 和C 基因型混合感染患者。不同HBV 基因型感染者的临床表现可能因HBV 基因型分布的地域、标本量和研究手段的不同而还难找出区别。

根据同一基因型内序列间的差异＞4%且＜8%的原则，C 基因型目前可被分为4 个亚型。最近香港一项研究发现，该地区流行的C 基因型主要为C1 亚型，占80%，其余为C2 亚型，未发现其他亚型[11]。目前关于中国大陆地区HBV 基因亚型的研究较少。肖蕾等研究显示广东地区流行的HBV 基因亚型以Ba 和C1 亚型为主，C2 亚型较少，Bj 亚型极为罕见[12]。本研究表明我国这些地区HBV 基因亚型主要为Ba 和C2 亚型为主，与赵鸿等的研究结果相符[13]。

目前 B3、B4 和 C3、C4 亚型只能依靠序列测定分析法来检测，不能用特异性引物PCR法检测。本研究采用的PCR 法只能检测Ba、Bj、C1 和C2 亚型，不能分出其他的亚型。因此，本研究方法还需要进一步完善。

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