超声法提取藏药唐古特乌头中多糖的研究

藏药唐古特乌头为毛茛科植物唐古特乌头[Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf]的干燥全草。夏末秋初开花期连根采挖，除去杂质,阴干。具有清热解毒、生肌收口、燥湿的功能。主治传染病引起的发热、肝胆热病、血症、胃热、疡疮、蛇蝎咬伤以及黄水病[1]。

多糖类物质广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁中，是生命有机体的重要组成部分，是除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子。研究表明多糖类物质具有多种生物活性，如抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副作用[2～5]。

作者在此研究了藏药唐古特乌头中多糖的最佳提取条件，用硫酸-苯酚法测定唐古特乌头中多糖的含量，以期为唐古特乌头的进一步研究和资源开发利用提供科学依据。

1 实验

1.1 药材、试剂和仪器

藏药唐古特乌头Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf(青海亚郎藏药材公司)，洗净，干燥,备用。

苯酚、葡萄糖(上海试剂三厂)、无水乙醇、浓硫酸等均为国产分析纯。

谱析T6型紫外可见分光光度计； 上海安亭TDL-40B型离心机； 上海亚荣RE52型旋转蒸发仪；天津泰斯特DK98-1型数显恒温水浴。

1.2 方法

1.2.1 藏药唐古特乌头多糖的提取

1.2.1.1 石油醚脱脂

称取5.0 g 藏药唐古特乌头样品于烧瓶中，加入100 mL 石油醚(沸程60～90℃)，在80℃的水浴中回流提取40 min，冷却，离心，回收石油醚，重复2次，将脱脂后的藏药唐古特乌头残渣挥干溶剂，备用。

1.2.1.2 回流提多糖

将脱脂后的藏药唐古特乌头粉碎至一定粒度，加入一定量蒸馏水，超声提取一定时间，冷却，4000 r· min-1离心5 min，抽滤，收集滤液，再将滤液在旋转蒸发仪中浓缩。

1.2.1.3 Sevage法除蛋白

将浓缩的多糖溶液倒入锥形瓶中，加入三氯甲烷-正丁醇(5∶1)混合溶液20 mL，剧烈振荡20 min，离心，收集上层溶液，重复操作，至离心后无蛋白质沉淀出现、通过紫外光谱检测无蛋白质吸收为止(本实验重复7次)。

1.2.1.4 乙醇沉淀多糖

将离心后的上层清液分别转入量筒中,测量体积，按1∶6的体积比加入无水乙醇，得到乙醇含量为80%的一系列多糖混合溶液，静置过夜，抽滤，滤渣真空干燥，得到藏药唐古特乌头多糖产品。

1.2.2 提取条件的优化

根据藏药唐古特乌头中多糖的极性大等特点，以提取液中多糖含量为优化指标，对提取时间、料液比(质量比，下同)和药材粒度等3个因素进行考察，每个因素取3个水平，根据L9(34)正交表进行实验，因素与水平见表1。

表1 正交实验的因素与水平

1.2.3 多糖含量的测定

1.2.3.1 测定波长的选择

多糖含量的测定有硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法等，研究表明硫酸-苯酚法的稳定性高于硫酸-蒽酮法[6]。以葡萄糖为标准品，精密吸取1.0 mL标准品溶液，置于50 mL 烧杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振荡摇匀，然后加入7 mL 浓硫酸并摇匀。显色35 min。置于比色皿中，在波长400～600 nm之间测定吸收光谱，确定最大吸收波长为486 nm。

1.2.3.2 标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，加适量蒸馏水溶解、定容至100 mL，作为葡萄糖标准溶液备用。精确量取葡萄糖标准溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL，分别定容至100 mL，再分别取1 mL于50 mL烧杯中，加入4%的苯酚溶液1 mL，振荡摇匀，然后加入7 mL 浓硫酸并摇匀。显色35 min。在486 nm处测量吸光度值，以吸光度值A为纵坐标、浓度c(μg· mL-1)为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程为：A=0.0054c+0.1417，R=0.9942。

1.2.3.3 藏药唐古特乌头提取液中多糖含量的测定

多糖产品用蒸馏水溶解，定容至500 mL，即为待测样液。吸取1.0 mL样液于100 mL容量瓶中，按1.2.3.2方法测得其吸光度值，由回归方程计算藏药唐古特乌头提取液中多糖的含量。

2 结果与讨论

2.1 最佳提取条件的确定

正交实验结果与分析见表2。

2.1.1 直观分析

由表2可知，各因素对藏药唐古特乌头中多糖提取的影响大小依次为：A>B>C,即料液比>提取时间>药材粒度，料液比对提取液中多糖含量的影响较大，药材粒度相对较小，各因素的最优水平组合为A3B2C2，即药材粒度为8目、料液比为1∶16、超声提取2 h。

表2 正交实验结果与分析

2.1.2 方差分析(表3)

表3 正交实验方差分析结果

由表3方差分析数据可知，因素A对指标有显著影响，因素C无显著影响，这与直观分析结果基本一致。

2.2 工艺条件的验证实验

为了考察最佳提取条件的稳定性，按该工艺条件进行3次重复性实验，结果见表4。

表4 工艺验证实验结果/%

由表4可知，藏药唐古特乌头提取液中多糖的平均含量为4.03%，RSD为0.16%，均优于正交实验表中的任何一组，说明该工艺稳定可行。

3 结论

通过正交实验，确定超声法提取藏药唐古特乌头中多糖的最佳提取条件为：唐古特乌头和水的质量比1∶16、超声提取2 h、药材粒度8目,在此条件下，提取液中多糖含量可达4.03%。该方法提取得率较高、稳定性好，可为藏药唐古特乌头药效的进一步研究和资源开发利用提供科学依据。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,2001:307.

[2] 赵宇,黄晓霞.多糖类化合物提取工艺研究[J].甘肃科技纵横,2006,35(2):223-224.

[3] 孙玉书,毕力夫,苏秀兰，等.多糖及多糖类药物研究概况[J].内蒙古医学院学报,2006,28(1):75-78.

[4] 石雪萍.植物多糖研究进展[J].粮食与油脂,2005，(8):8-11.

[5] 卓佳,赵浩如.近十年日本植物多糖提取纯化技术的发明专利[J].药学进展,2005,29(6):276-280.

[6] 钟方晓,任海华,李岩.多糖含量测定方法比较[J].时珍国医国药,2007,18(8):1916-1917.