治疗奶牛乳腺炎蒙药复方提取物抗大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作用研究*

包金荣,王纯洁,战永波,敖日格乐,吴海燕

(内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古呼和浩特 010018)

治疗奶牛乳腺炎蒙药复方提取物
抗大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作用研究*

包金荣,王纯洁*,战永波,敖日格乐,吴海燕

(内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古呼和浩特 010018)

对两种蒙药复方进行乙醇回流提取,然后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚层浸膏、乙酸乙酯层浸膏、正丁醇层浸膏和水母液浸膏,并分别对各种提取物进行奶牛乳腺炎两种主要致病菌大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌和体内抗菌作用,用牛津杯法测定提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径,用二倍稀释法测定了其在体外的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。又以两种致病菌的混合菌感染小鼠,灌服蒙药复方提取物以测定其体内抗菌效果。结果表明,两种蒙药复方的体外抑菌成分主要集中在乙酸乙酯层浸膏和正丁醇层浸膏内,抑菌环直径均大于16.88 mm,最大达到21.61 mm;对两种致病菌的MIC和MBC最低可达到0.031 5 g/mL和0.062 5 g/mL;两种蒙药复方提取物的体内抗菌成分重要集中在石油醚层浸膏和水母液浸膏内,对小鼠死亡保护率明显高于阴性对照组,可达87.5%。

蒙药;抑菌;小鼠;存活率

*通讯作者

奶牛乳房炎主要由金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和链球菌等致病菌引起[1-2],是导致奶牛业经济损失最严重的疾病[3-4]。传统奶牛乳腺炎治疗方法多采用抗生素,但随着耐药菌株的不断增多和耐药性的不断变化[5-6],食品中抗生素的残留问题日益受到人们的关注[7],迫切需要一种安全、绿色的奶牛乳腺炎治疗方法。蒙药是纯天然药物,含有多种生物有效成分[8]。本研究旨在对已研发出的治疗奶牛乳房炎的两种蒙药复方的活性部位进行初步定位,对奶牛场乳房炎奶样中分离出的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌进行体外抑菌和体内抗菌试验,为该蒙药复方的进一步研究奠定基础,也为研发治疗奶牛乳房炎的蒙药制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及药物 普通琼脂、伊红美蓝琼脂、血琼脂培养基,普通肉汤,均按常规方法配制;蒙药购自呼和浩特九合永龄堂。方Ⅰ:诃子70 g,大黄70 g,连翘 35 g,蒲公英70 g,乳香 30 g,没药30 g,牛蒡子30 g等七味蒙药复方(内蒙古农业大学生理实验室结合正交设计和蒙医药理论研制,以下简称正交复方);方 Ⅱ:诃子50 g,黄柏 50 g,栀子50 g,大黄50 g,胡黄连50 g,姜黄 50 g,川楝子 50 g等七味蒙药(传统蒙医药复方,以下简称传统复方),蒙药单药购于呼和浩特九合永龄堂。

1.1.2 实验动物 100只昆明系小鼠,雌雄各半,体重20 g±2 g,购于内蒙古大学实验动物中心。

1.1.3 菌种 由内蒙古农业大学生理实验室在呼和浩特地区牛场乳腺炎奶样分离出金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌。

1.2 方法

1.2.1 抑菌直径测定 两种干燥蒙药复方各5 kg,粉碎。每次取200 g复方加入2 000 mL的三颈烧瓶中,加入 800 mL工业酒精,用水浴锅加热至回流,分别提取3次,每次提取1.5 h。过滤,合并提取液,减压浓缩提取液,回收酒精后,蒙药方Ⅰ、Ⅱ分别得到1 600 g和1 250 g的含水初浸膏。将两种蒙药复方含水初浸膏分别分散于适量水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶剂,蒙药复方Ⅰ得到石油醚层浸膏56 g,乙酸乙酯层浸膏180 g,正丁醇层浸膏230 g,水母液浸膏。蒙药复方Ⅱ得到石油醚层浸膏36 g,乙酸乙酯层浸膏165 g,正丁醇层浸膏200 g。将各提取物分散在水中,制成0.1 g/mL药液,采用牛津杯法,加入100 μL药液于制备的带有菌层的平皿中,盖好,37℃培养24 h,测量抑菌圈直径,大于 15 mm为极度敏感;大于10 mm小于15 mm为高度极敏;大于8 mm小于10 mm为敏感;小于8 mm为不敏感[9]。

1.2.2 MIC和MBC的测定 以营养肉汤2倍稀释 4 种方药,使药液浓度为 1.0 、0.5、0.25 、0.125、0.062 5、0.031 25 g/mL各试管中分别加入上述制备的菌液50 μL,摇匀,37℃培养24 h,以不显示浊度细菌为生长时药物浓度作为MIC。再从未见细菌生长的各试管培养物中分别吸取50 μL,接种于平皿琼脂培养基上,37℃培养24 h。生长的菌落数小于5个菌落的药液浓度,即为最低杀菌浓度(MBC)[10]。

1.2.3 体内抑菌试验 试验小鼠随机分成10组,每组10只,阳性对照组,阴性对照组,正交复方水母液组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组、石油醚萃取物组及传统复方水母液组、乙酸乙酯萃取物组、正丁醇萃取物组、石油醚萃取物组等。阳性对照组灌服0.6%环丙沙星药液0.13 g/kg;阴性对照组灌服灭菌自来水20 g/kg,其他各组分别灌胃2 g/kg。各组小鼠在感染菌液之前每天灌胃2次,连续7 d,末次给药1 h后给每只小鼠腹腔注射80%最低致死量(MLD)混合致病菌,观察感染后2 d内各组小鼠的死亡情况,计算保护率,保护率=(阴性对照组死亡数-处理组死亡数)/阴性对照动物死亡数×100%。

1.2.4 数据分析 采用SAS8.0软件进行方差分析,用±S的方式表示。

2 结果

2.1 蒙药复方提取物体外抑菌直径

除石油醚萃取物外,致病菌对其他两种蒙药复方的提取物均达到高度敏感,其中对正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物达到极度敏感;对正交复方石油醚萃取物不敏感,对传统复方石油醚萃取物敏感;并且乙酸乙酯和正丁醇萃取物对致病菌的体外抑菌直径均显著高于水母液,极显著高于石油醚萃取物(表1)。

表1 蒙药复方提取物体外抑菌直径Table 1 T he bacteriostasis diameter of the Mongolian compound ex tracts

2.2 蒙药复方提取物的MIC和MBC

两种蒙药复方的正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物对两种致病菌均有显著抑菌效果,MIC和MBC分别达到 0.031 25 g/mL、0.062 5 g/mL和0.062 5 g/mL、0.125g/mL;水 母 液次 之为0.125 g/mL和0.25 g/mL,而石油醚萃取物基本无体外抑菌效果(表2)。

2.3 体内抗菌试验

由表3可知,试验组对小鼠死亡保护率均显著高于阴性对照组(P＜0.05),其中两种蒙药复方的水母液对小鼠的保护率为75%,与阳性对照组相当,传统蒙药复方的石油醚萃取物对混合菌感染小鼠的保护率高达87.5%,高于阳性对照组。

表2 蒙药复方提取物体外MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of the Mongolian compound ex tracts in vitro

表3 蒙药复方提取物对混合菌液感染小鼠的保护率测定结果Table 3 Determination of protection rate of mice infected by mixed bacteria suspension

3 讨论

蒙药是纯天然的绿色药物,含有多种抑菌药物,从而为新型治疗奶牛乳房炎药物的研发提供了保证[11]。蒙药复方提取物体外抑菌试验表明,这两种蒙药复方的体外抑菌有效成分主要集中在乙酸乙酯和正丁醇萃取物中,水母液略有抑菌作用,而石油醚萃取物基本无体外抑菌效果。蒙药复方提取物的体内抗菌试验表明,蒙药复方体内活性成分主要集中在水母液和石油醚萃取物中,乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的活性较小。

长期以来,人们在研发抗菌消炎药物时,对药物的体外抑菌效果非常重视,甚至作为主要参考指标,但本研究表明这两种蒙药复方提取物的体外抑菌效果与体内抗菌效果并不一致,这可能与药物体内代谢转化,以及抗炎、免疫增强等作用有关[12],其具体机理有待于进一步研究。

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Effect of Compound Mongolian Medicine Extract Curing Cow Mastitis on Anti-Escherichia coliandStaphylococcus aureus

BAO Jin-rong,WANG Chun-jie,ZHAN Yong-bo,AO Ri-ge-le,WU Hai-yan

(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agriculture University,Huhhot,Inner Mongolia,010018,China)

T o study the antibacterial effect of compound Mongolian medicine extract on two main pathogenic bacteria,Staphy lococcus aureusandEscherichia coliof cow mastitis,in vitroandin vivo,the bacteriostasis circle diameters of the exstracts were determined by Oxford cup law,the minimal inhibitory concentration(MIC)and minimal bactericidal concentration(MBC)of compound Mongolian medicine extracts were examinedin vitroby two times dilution method.Besides,the antibacterial effect of Mongolian medicine extracts on the mice infected withStaphylococcus aureusandEscherichia colimixed suspension was observed.The results showed that two extracts had significant inhibiting effect on the two kinds of bacteria;bacteriostasis circle diameter were more than 16.88 mm,up to 21.61 mm mostly.The strongest inhibitory action of compound extracts in MIC and MBC were 0.031 5 g/mL and 0.062 5 g/mL,respectively.The survival rate of infected mice were higher than that of negative control after taking the compound extracts orally,the highest of which was 87.5%.

Mongolian medicine;anti-bacterium;mouse;survival rate

S859.3

A

1007-5038(2010)09-0055-04

2009-12-29

内蒙古自然科学基金重点项目(200607010403);教育部春晖计划启动资金;内蒙古教育厅高校项目(NJZY07042)

包金荣(1985-),女(蒙古族),内蒙古通辽人,硕士研究生,主要从事动物免疫生理学研究。