龙葵生物碱诱导HeLa细胞凋亡的研究*

贾艳菊,代 玲,张 灿

(1.河北经贸大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050061;2.邢台医学高等专科学校基础部,河北邢台 054000;3.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109)

龙葵生物碱诱导HeLa细胞凋亡的研究*

贾艳菊1,代 玲2,张 灿3*

(1.河北经贸大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050061;2.邢台医学高等专科学校基础部,河北邢台 054000;3.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109)

用M TT法观察龙葵生物碱的体外抗肿瘤作用,用T UNEL染色法检测龙葵生物碱对HeLa细胞凋亡的影响,用免疫细胞化学方法研究龙葵生物碱对HeLa细胞PCNA和突变型P53蛋白表达的影响。浓度为100 μ g/mL～800 μ g/mL的龙葵生物碱对HeLa细胞的生长均表现出一定的抑制作用;TUNEL染色结果提示400 μ g/mL的龙葵生物碱处理HeLa细胞48 h后,能够诱导更多的细胞出现凋亡;免疫细胞化学分析结果显示,400 μ g/mL的龙葵生物碱处理HeLa细胞48 h后,会使HeLa细胞中PCNA蛋白和突变型P53蛋白表达量显著下调。结果表明,龙葵生物碱在体外具显著抗宫颈癌活性,其作用机制是通过诱导更多的细胞出现凋亡而实现的。

龙葵生物碱;MT T;T UNEL染色;PCNA;突变型P53;HeLa细胞

中药龙葵(Solanum nigrumL)是茄科植物龙葵的地上部分,其全草含多种甾体生物碱,包括澳洲茄边碱(solamargine)、澳洲茄碱(solasonine)、龙葵碱(solanine)等,也含皂甙等成分。生物碱类化合物大多都能诱导肿瘤细胞凋亡,细胞凋亡与肿瘤的发生密切相关,肿瘤的发生可能是由于细胞凋亡的通路受阻造成的[1-2]。一些研究报道表明,龙葵的醇提物能够抑制乳腺癌的生长并能诱导细胞凋亡[3],其中的澳洲茄边碱有明显的抗肿瘤作用[4]。龙葵制剂对无转移恶性葡萄胎、手术切除放疗、化疗后绒毛膜癌、卵巢癌药物作用机制研究已经展开;对食道癌、膀胱癌抑制机制的研究已有报道[5],但龙葵生物碱对宫颈癌的治疗作用国内外尚未见相关报道。

本试验将分离提取的龙葵生物碱作用于人宫颈癌细胞株(HeLa),进行体外培养试验,观察药物对该细胞株增殖的影响,并进一步探讨龙葵生物碱抑制细胞增殖的作用机制,为进一步开发利用龙葵提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 龙葵生物碱 龙葵购于青岛市同仁堂药店,经同仁堂医师鉴定为龙葵。龙葵生物碱的提取参考庞琳琳等[6]的提取方法,并适当改进。

1.1.2 供试细胞 人宫颈癌HeLa细胞株购于中国医学科学院。

1.1.3 主要试剂 超级无支原体胎牛血清、RPMI1640、青霉素、链霉素、胰蛋白酶购于Gibco公司;M TT为Sigma公司产品;鼠抗人单克隆抗体P53、PCNA,羊抗鼠单克隆抗体IgG-H RP为Santa Cruz公司产品;T UNEL染色试剂盒购于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞株,以含100 mL/L胎牛血清、1万单位青霉素、100 mg/L链霉素的 RPMI1640培养基,在37℃、50 mL/L的CO2条件下培养。5 g/L胰酶与1 g/L EDTA等体积混合消化细胞,隔日传代1次。

1.2.2 细胞存活率 参照文献[7]介绍方法进行。细胞接种于96孔培养板,每孔接细胞1.0×104个。培养 24 h,加入不同浓度(10、50、100、200、400、800 μ g/mL)的药物 10 μ L(以 RPMI1640 培养液稀释),对照组加入同体积的RPMI1640培养液,每组设3个平行孔,充分混匀后,继续培养48 h。每孔加入 MT T 20 μ L(5 g/L,PBS),继续培养 4 h后 ,每孔加入DMSO 150 μ L,充分震荡溶解,Multiscan MK3型酶标仪在492 nm波长处测定各孔OD值,调零孔则用RPMI1640代替细胞悬液和药物。试验重复3次。细胞生长抑制率按下列公式进行计算:

生长抑制率(IR%)=[1-试验组平均OD值/对照组平均OD值]×100%

1.2.3 TUNEL染色检测细胞凋亡 经药物处理后及对照组细胞制成单细胞悬液,调节细胞浓度为5×106个细胞/mL,制备细胞涂片(40 mL/L多聚甲醛固定),然后按试剂盒说明书操作。显微镜下观察细胞中含有蓝紫色颗粒的细胞即为凋亡的细胞。以上试验重复二次。

1.2.4 突变型P53和PCNA蛋白免疫细胞化学分析 用400 μ g/mL龙葵生物碱处理后及对照组细胞用PBS液制成单细胞悬液,调节细胞浓度为2×106个细胞/mL,滴片,室温下自然干燥,然后按试剂盒说明书进行操作。以2×105个细胞/孔接种于放置有盖玻片的6孔板,待自然贴壁后药物处理48 h后取出置于培养皿中长满细胞的盖玻片,免疫细胞化学检测试剂盒进行SP法免疫组化染色,光镜低倍镜下随机确定5个视野,每个视野随机计数200个肿瘤细胞计算突变型P53和PCNA阳性率。

1.2.5 统计分析 用Statisticas 6.0统计软件对结果进行分析,细胞存活率组间差异采用单因素方差分析、多重比较采用邓肯检验,突变型P53和PCNA阳性率的组间差异采用t检验。P＜0.05,为统计学差异显著。

2 结果

2.1 龙葵生物碱对肿瘤细胞生长的抑制作用

试验结果表明,不同处理组的OD值存在显著差异(F(7,16)=189.5,P=0.00),各龙葵生物碱处理组OD值与空白对照组的相比差异显著(P＜0.05),并且随浓度的增加OD值逐渐降低。质量浓度为100 μ g/mL～800 μ g/mL的龙葵生物碱对He-La细胞的生长表现出一定的抑制作用,且随着浓度的增加抑制率逐渐增加(F(6,14)=140.8,P=0.00),当浓度为800 μ g/mL时,龙葵生物碱对 HeLa细胞增殖抑制率可达69.27%,与阳性药物5-Fu处理效果无显著差异(P＞0.05)(表1)。

表1 龙葵生物碱对HeLa细胞的增殖抑制作用Table 1 Effect of solanine on proliferative activity of HeLa cell line in vitro(±SD)

表1 龙葵生物碱对HeLa细胞的增殖抑制作用Table 1 Effect of solanine on proliferative activity of HeLa cell line in vitro(±SD)

注:上标字母不同,表示差异显著P＜0.05。Note:Values with different letters show significant difference P＜0.05.

浓度/(μ g◦mL-1)Concentration OD值OD value IR/%Control 1.178±0.018f 10 1.088±0.024e 7.64±3.24a 50 1.017±0.070e 13.67±6.28a 100 0.789±0.023d 33.02±1.94b 200 0.660±0.043c 43.97±4.25c 400 0.521±0.021b 55.77±1.42d 800 0.362±0.074a 69.27±4.42e 5-Fu 0.342±0.018a 70.97±1.43e

2.2 龙葵生物碱对HeLa细胞凋亡的影响

DNA片段化是细胞凋亡的一个标志,TUNEL染色结果如图1所示。与阴性对照组相比,浓度为400 μ g/mL龙葵生物碱处理的HeLa细胞,TUNEL染色后的细胞爬片出现强烈绿色荧光,提示龙葵生物碱在体外能显著诱导更多的HeLa细胞发生凋亡。

2.3 龙葵生物碱对HeLa细胞P53蛋白、核增殖抗原(PCNA)蛋白表达的影响

为了进一步阐明龙葵生物碱诱导细胞凋亡的途径,通过免疫组织化学的方法检测龙葵生物碱处理后对HeLa细胞突变型P53和PCNA蛋白表达的影响,结果如图2和图3所示。从结果中可以看出,龙葵生物碱处理可以使HeLa细胞突变型p53蛋白表达阳性细胞显著减少(30.3%±7.7%),与阴性对照组(87.1%±8.9%)相比,差异极显著(P＜0.01);龙葵生物碱可以使HeLa细胞PCNA蛋白表达阳性细胞显著减少,阳性表达率为29.5%±9.2%,与阴性对照组(61.7%±7.1%)相比,差异也达显著水平(P＜0.05)。

图1 龙葵生物碱处理对HeLa细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of solanine on the HeLa cell apoptosis

图2 龙葵生物碱处理对HeLa细胞PCNA蛋白表达的影响Fig.2 Effect of solanine on the PCNA protein expression of HeLa cells

图3 龙葵生物碱处理对HeLa细胞突变型P53蛋白表达的影响Fig.3 Effect of solanine on the mutant P53 protein expression of HeLa cells

3 讨论

子宫颈癌是妇科临床比较常见的恶性肿瘤,可分为鳞状细胞癌、腺癌及其他类,其中鳞状细胞癌约占85%～90%。近几年来研究表明,肿瘤的发生不仅是由于细胞的无限生长,而且细胞生长抑制因子的丧失及细胞凋亡的异常同样会引起肿瘤的形成。

植物生物碱是一类有广泛生物活性效应的成分,近些年的研究表明,多种植物生物碱均显示出了较强的抗肿瘤活性,如马齿苋生物碱对A-549肺癌细胞株[8]、野西瓜生物碱对 HepG-2细胞株均显示出很强的抗增殖活性[6]等。其抗肿瘤作用的机理与对细胞的直接杀伤作用[9]、干扰细胞周期作用[10]、诱导细胞分化[11]、诱导细胞凋亡[12]、逆转细胞抗凋亡作用[13]等有关。本试验首次观察了龙葵生物碱对人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响,结果表明,龙葵生物碱体外对HeLa细胞的增殖具有较好的抑制作用,且随龙葵生物碱浓度的增加而抑制效果增强,在处理浓度为800 μ g/mL时,细胞增殖抑制率可达69.27%。T UNEL染色结果显示,龙葵生物碱处理以后,细胞爬片的荧光强度与阴性对照组相比显著增强,提示龙葵生物碱诱导了更多的细胞出现凋亡。

增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA多聚酶δ的辅助蛋白,在细胞周期的G1后期开始增加,S期达到高峰,直接参加了细胞增殖过程中的DNA复制,其表达和含量反映了细胞的增殖活性。PCNA等抗原表达可作为预测肿瘤对化疗药物的敏感程度[14],免疫细胞化学检测结果表明,龙葵生物碱处理后,PCNA蛋白表达量显著降低,提示药物处理使细胞增殖活性显著降低,该结果与M TT试验结果相一致。

与野生型P53作为一种肿瘤抑制基因不同,突变型P53是一种癌基因,它的过量表达可能通过使细胞更易增殖而增加了细胞的稳定性,并且它还可以抑制DNA的修复和凋亡。除此之外,还有文献表明突变型P53可以激活端粒酶、激活抗血管生成因子的形成以及促进肿瘤细胞的转移。更为重要的是,有研究表明P53的突变与Bcl-2的过量表达有关[15]。利用免疫细胞化学方法检测到的是突变型P53的表达,从试验结果来看,龙葵生物碱处理后可以使HeLa细胞突变型P53蛋白的表达量显著下调,提示龙葵生物碱可能通过下调突变型P53而修复野生型P53功能,进而诱导细胞出现更多的凋亡。

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Study on Apoptosis of HeLa Cells Induced by Solanine

JIA Yan-ju1,DAI Ling2,ZHANG Can3

(1.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Economics&Business,Shijiazhuang,Hebei,050061,China;2.Foundation Department,Xingtai Medical College,Xingtai,Hebei,054000;3.College of Animal Science,Qingdao Agriculture University,Qingdao,Shandong,266109,China)

MTT method was used to explore the anti-neoplastic action of solaninein vitro,T UNEL staining was used to analyze the apoptosis-inducing effect of solanine on HeLa cell line,and immumunocytochemistry method was further used to detect the effects of solanine on the protein expression of PCNA and mutant P53 in HeLa cell line.100 μ g/mL-800 μ g/mL solanine had certain inhibition effect on the growth of HeLa cell line.TUNEL staining results showed that after the treatment of solanine at a dose of 400 μ g/mL for 48 h,more HeLa cells were induced to apoptosis.Immumunocytochemistry analysis showed that after the treatment of solanine at a dose of 400 μ g/mL for 48 h,the expression of PCNA protein and the mutant P53 protein were all down-regulated in HeLa cells.T hese results indicated that solanine had significant anticervical cancer effectin vitro,and its anti-tumor mechanism be correlated with its cell apoptosis-inducing action.

solanine;MTT;T UNEL staining;PCNA;mutant P53;HeLa cell

R285

A

1007-5038(2010)08-0051-04

2010-01-15

贾艳菊(1977-),女,河北石家庄人,讲师,博士,主要从事水生生物学研究。*通讯作者