铜绿假单胞菌抗体制备及抑菌作用*

陈 煜,杨燕凌,谢小芳,肖西志

(1.福建农林科技大学生命科学学院,福建福州 350002;2.山东出入境检验检疫局,山东青岛 266002;3.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵 712100)

铜绿假单胞菌抗体制备及抑菌作用*

陈 煜1,杨燕凌1,谢小芳1,肖西志2,3*

(1.福建农林科技大学生命科学学院,福建福州 350002;2.山东出入境检验检疫局,山东青岛 266002;3.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵 712100)

研究铜绿假单胞菌抗体对铜绿假单胞菌生长的抑制作用。制备兔抗铜绿假单胞菌抗体,纯化后加入液体和固体培养基中,接种沙门菌和铜绿假单胞菌混合物,对沙门菌进行选择分离。试验表明,添加抗体后能够成功抑制铜绿假单胞菌的生长,而不影响沙门菌的分离。将200 μ L和400 μ L铜绿假单胞菌抗体添加入相应培养基中,能够抑制铜绿假单胞菌的生长,而达到筛选沙门菌的目的。

铜绿假单胞菌;抗体;培养基;抑菌作用

铜绿假单胞菌形态为直或稍弯、两端钝圆的杆菌,革兰氏染色阴性,专性需氧。在自然界分布广泛,为土壤中存在的最常见的细菌之一,也是临床上的机会性致病菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌最适生长温度35℃,在41℃也能生长。虽然在动物性饲料检测项目中不包括铜绿假单胞菌,但它的存在会对沙门菌的检测造成干扰,特别是在一些显色培养基中,铜绿假单胞菌与沙门菌表现出同样的菌落颜色。因此,研究能抑制铜绿假单胞菌检出的培养基将有助于沙门菌的检测和鉴定,减少工作量。将抗体添加到培养基中研究其体外抗菌作用是临床细菌性疾病的免疫治疗的方法之一[1-2],同时也应用于抑制口腔中变形杆菌的黏附[3-4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 铜绿假单胞菌由山东出入境检验检疫局技术中心农产品检测中心分离并保存;鼠伤寒沙门菌(IQCC10503)由中国检验检疫科学院食品所馈赠;阴沟肠杆菌为本实验室分离并保存。

1.1.2 试验用动物 新西兰大白兔购自青岛市食品药品监察所。

1.1.3 主要试剂和仪器 VITEK GN鉴定卡,为法国梅里埃公司产品;亚烯酸盐胱氨酸肉汤(SC)、氯化镁孔雀绿肉汤(MM)北京陆桥公司产品;营养琼脂,均为OXOID公司产品;硫酸铵,为国药集团化学试剂有限公司产品;PICODROP分光光度计(型号:PICOPET01),VITEK微生物鉴定系统。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制备 将铜绿假单胞菌接种营养琼脂平板,37℃,24 h,刮取培养物,溶于生理盐水中,充分溶解后分装到灭菌小试管内,每管5 mL,分装 4管。分别加入甲醛溶液 5、10、20、40 μ L,37 ℃下作用1 h后,分别接种营养琼脂平板,检测灭活效果。取无细菌生长的最小稀释度作为免疫原。

1.2.2 免疫原蛋白含量的检测 将制备的免疫原吸取2 μ L在PICODROP分光光度计上进行蛋白含量检测。

1.2.3 免疫接种 用灭活的免疫原接种4只新西兰大白兔,于初免后14 d进行二免,二免后30 d后加强免疫。加强免疫后1周内采血,分离血清,AGD法测抗体效价。

1.2.4 抗体纯化 采用饱和硫酸铵法对分离的兔血清进行纯化,具体操作按文献[5]进行。

1.2.5 抑菌试验的抗体用量的确定 分别取纯化的抗体 25、50、100、200 μ L 接种于灭菌的10 mL营养肉汤中,然后往营养肉汤中加入100 μ L铜绿假单胞菌菌液100 μ L(1×109cfu),37 ℃培养24 h。用培养的营养肉汤接种营养琼脂平板,37℃培养24 h。

1.2.6 液体培养基中的抑菌试验 分别取100、200、400、800、1 600 μ L 的 1.2.5 中确定的抗体用量加入到5瓶灭菌的SC培养基中(100 mL),另外2瓶SC作为对照,即只接种1×109cfu的铜绿假单胞菌菌液,37℃,24 h后接种营养琼脂和沙门菌显色培养基;分别取 100、200、400 μ L 的 1.2.5 中确定的稀释度抗体加入到灭菌的装有MM的试管中(10 mL),另外2管作为对照,即只接种 100 μ L 1×109cfu的铜绿假单胞菌菌液,然后再加入 100 μ L 1×109cfu的铜绿假单胞菌菌液,42℃,24 h后接种营养琼脂和沙门菌显色培养基[6]。

1.2.7 固体培养基中的抑菌试验 取100、200、400、800、1 600 μ L铜绿假单胞菌抗体与沙门菌显色培养基(50℃～60℃)混合,然后倒平板,接种铜绿假单胞菌,设置2个对照,即不加抗体的铜绿假单胞菌菌液直接接种沙门菌显色培养基,37℃,24 h后观察结果。

1.2.8 沙门菌的选择分离 取100 μ L铜绿假单胞菌抗体与100 μ L铜绿假单胞菌,然后将沙门菌菌液100 μ L同上述的混合液一起接种SC和MM,24 h后,将培养物接种沙门菌显色培养基,37℃,12 h～24 h;将阴沟肠杆菌作为对照,接种于含有铜绿假单胞菌和抗体的培养基中。将分离的菌落进行纯培养后用VITEK鉴定系统鉴定。

1.2.9 VITEK鉴定 将1.2.8中的分离的单菌落纯培养后用VITEK GN(革兰阴性鉴定卡)鉴定。

1.2.10 模拟试验 将铜绿假单胞菌和沙门菌分别掺到经高压灭菌的鱼饲料、牛肉骨粉中,放入干燥箱中,37℃干燥。干燥后取25 g接种BPW(缓冲蛋白胨水),37℃,24 h。增菌后接种于含有铜绿假单胞菌抗体的SC和MM培养基中,抗体接种量为50、100、200、400 μ L。 SC,37 ℃,24 h;MM,42 ℃,24 h[7]。然后将SC、MM 的增菌液接种沙门菌显色培养基,37℃,12 h～24 h。将分离的单菌落纯培养后,用VITEK鉴定仪鉴定。

2 结果

2.1 免疫原的制备

经无菌检测,向铜绿假单胞菌菌液中加甲醛至20 μ L时 ,无细菌生长。

2.2 免疫原的检测

灭活的铜绿假单胞菌菌液经PICODROP分光光度计检测,含量为10.65 mg/mL。

2.3 抗体效价测定

使用AGD法,所分离的血清效价为1∶64。按文献[5]方法,用饱和硫酸铵法纯化抗体。

2.4 抗体用量的确定

接种营养肉汤,37℃,24 h后,抗体接种为100 μ L和 200 μ L 时 ,营养肉汤中明显有白色沉淀,培养液清亮;而接种抗体 25 μ L和50 μ L 的营养肉汤试管内培养液为浑浊。将上述培养液接种营养琼脂平板后 ,接种 25 μ L 和 50 μ L 抗体的营养肉汤有细菌生长,而接种为100 μ L 和 200 μ L 抗体的营养肉汤培养物无菌落生长,结果见表1。

表1 接种营养肉汤后铜绿假单胞菌抗体用量Table 1 Confirmation of the P.Aeruginosa antibody doses in broth after inoculating P.aerugilnosa

2.5 液体培养基的抑菌试验

当抗体接种量为1 600 μ L时,SC培养基中不能分离到铜绿假单胞菌菌;当抗体接种量为100 μ L时,MM培养基中不能分离到铜绿假单胞菌。

2.6 固体培养基的抑菌试验

对照组生长出紫色菌落,试验组中全部有紫色菌落,但菌落数比对照组少,结果见表2。

表2 铜绿假单胞菌抗体与沙门菌固体培养基的抑菌试验Table 2 Antibacterial assay of P.aeruginosa antibody and S.salmonella solid media

2.7 沙门菌选择分离

1.2.8中沙门菌显色培养基上长出紫色菌落。纯培养物用VITEK GN鉴定卡进行鉴定,表明实验组中分离的细菌经鉴定为沙门菌,对照组为阴沟肠杆菌。

2.8 模拟试验结果

经VITEK 鉴定,50 μ L 和100 μ L 抗体接种的平板长出沙门菌和铜绿假单胞菌,而接种200 μ L,400 μ L抗体的的只有沙门菌生长,结果见表3。

表3模拟试验Table 3 Mimicry assay

3 讨论

为了提高培养基的选择性,目前有以下几种方法:①在培养基中添加抗生素,该方案应用于基因工程中重组子的筛选,如在 LB培养基中加入卡那霉素,可以将插入了外源基因的大肠埃希菌筛选出来;②在培养基中添加呋喃类抑菌物质[8];③喹诺酮类[9];④小分子肽[10];⑤利用酶催化反应,在培养基中加入酶的底物,产这种酶的细菌将在培养基中显示相应的颜色,这也是当前显色培养基生产所采用的方法。目前,还没有将相应抗体加入培养基来提高培养基选择性的研究。

沙门菌是进出口动物性饲料的法检项目之一,通常存在于未经加热处理的牛羊肉骨粉中,而白鱼粉、红鱼粉等经过热处理的饲料中沙门菌较少。但存在于其中的肠杆菌科其他细菌在沙门菌的检测中常能引起干扰,给沙门菌的分离、鉴定工作带来很大麻烦。目前沙门菌的检测首先是用BPW进行预增菌,然后经SC和MM 进行选择性增菌,最后经选择性培养基进行分离。为了加快沙门菌的分离,一些公司利用沙门菌的特异酶开发了沙门菌的显色培养基,通过所分离细菌的菌落颜色来判断是否为沙门菌。但通过大量的检测发现,这些培养基对沙门菌的分离并不具有特异性,一些细菌的菌落与沙门菌的菌落颜色相同,即也为紫色,铜绿假单胞菌菌即为其中之一。为了提高培养基的选择性,加快沙门菌的分离鉴定,我们通过向培养基中添加铜绿假单胞菌的抗体,来实现抑制铜绿假单胞菌的生长,从而排除沙门菌分离过程中铜绿假单胞菌造成的干扰。

本研究结果显示,在液体培养基中添加铜绿假单胞菌的抗体能够抑制该菌的生长,而且不影响沙门菌的分离。但在固体培养基中的效果却不如液体培养基效果好,并不能完全抑制铜绿假单胞菌的生长,当添加抗体量较大时才会稍出现轻微的抑制,估计这与抗体作用的发挥主要是在液体环境中有关,另外一个原因可能是菌体在固体培养基表面生长,存在于培养基中的抗体与菌体的结合没有液体中那样充分,也就不能发挥其抑菌作用。

虽然沙门菌的鉴定方法很多,如PCR方法,这些方法具有快速、成本低等有点,但沙门菌检测方法的“金标准”仍是细菌分离、鉴定,尽管细菌的分离鉴定工作耗时长、成本高,但通过两步增菌能够使存在于检测样品中的沙门菌大量增加,为后面的鉴定提供了足够数量的“模版”。

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Antibody Preparation ofP.aeruginosaand Research on Antibacterial Effect

CHEN Yu1,YANG Yan-ling1,XIE Xiao-fang1,XIAO Xi-zhi2,3

(1.College of Li fe Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian,350002,China;2.Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong,266002,China;3.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

To investigate the growth inhibition ofP.aeruginosathrough adding its antibody into media and accomplish the screening ofS.salmonella.The antibody ofP.aeruginosawere prepared and added into liquid and solid media after purification.S.salmonellaandP.aeruginosawere inoculated into the media and the cultures were evaluated.The growth ofP.aeruginosawas inhibited when its antibody was added into media,whereas the growth ofS.salmonellawas not.The growth ofP.aeruginosawas inhibited when its antibody was added into media and resulted in the screening ofS.salmonella.

P.aeruginosa;antibody;antibacterial effect;medium

S852.614

A

1007-5038(2010)08-0038-04

2009-12-25

山东出入境检验检疫局科技项目(SK200809)

陈 煜(1977-),女,四川泸州人,讲师,主要从事分子生物学的教学和科研工作。*通讯作者