微载体培养PK-15细胞试验条件的优化

何锡忠,李春华,倪建平,蒋风英,邹 勇*

(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海 201106;2.上海佳牧生物制品有限公司,上海 201106)

微载体培养PK-15细胞试验条件的优化

何锡忠1,李春华1,倪建平2,蒋风英1,邹 勇1*

(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海 201106;2.上海佳牧生物制品有限公司,上海 201106)

为了优化PK-15细胞在微载体上的生长条件,在微载体浓度5 mg/mL、低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液条件下,观察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的细胞接种密度对细胞生长的影响;在低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液、接种密度5×104cells/mg条件下,观察3、5、10 mg/mL微载体浓度对细胞生长的影响;在3 mg/mL微载体浓度条件下、接种密度25×104cells/mL,观察MEM、高糖DMEM和低糖DMEM培养基对细胞生长的影响。结果表明,以微载体接种细胞密度4.5×104cells/mg、微载体浓度5 mg/mL在低糖DMEM培养基中培养方式效果最为理想。优化的培养工艺适用于PK-15细胞的生产。

微载体培养;PK-15细胞;培养条件

目前,我国病毒性疫苗的生产多采用扁瓶和滚瓶等静置培养技术进行细胞培养和病毒复制,劳动强度高,占地面积大,而且生产不稳定,很难进行质量控制。Van Wezel A L[1]于1967年首先应用微载体系统培养贴壁依赖性细胞,此后这一技术得到了迅速发展。微载体系统由于具有高比表面积、细胞产量高、培养环境便于检测和控制、生产规模易于放大等优点,已广泛应用于狂犬病、脊髓灰质炎等疫苗的生产[2-3];对80种以上的贴壁细胞成功进行了大规模扩增,如293细胞、成肌细胞、CHO 细胞、Vero细胞[3-7]、Marc细胞[8]和ST细胞[9]等。由于细胞培养环境和微载体培养系统的操作条件影响不同细胞生长代谢和生理状况,笔者通过研究细胞接种密度、微载体浓度和不同培养基种类与PK-15细胞生长的关系,考察培养过程中的限制性因素对PK-15细胞生长的影响,为获得生长良好的高密度PK-15细胞培养提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 PK-15细胞(无PCV-1污染)由上海市农业科学院畜牧兽医研究所研发中心保存。

1.1.2 培养基 MEM、高糖 DMEM 和低糖DMEM为美国GIBCO-RBL公司产品;新生牛血清为Hyclone公司产品。

1.1.3 微载体(Cytodex TM 3) CT-3微载体购自Amersham pharmacia Biotch AB,使用前经无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液浸泡,1.055 kg/cm2高压蒸汽灭菌30 min,再浸泡在含100 mL/L新生小牛血清的低糖DMEM 培养液中,置37℃、体积分数为5%CO2培养箱过夜,待用。

1.1.4 转瓶 由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室制备,总体积250 mL。

1.1.5 CelliGen生物反应器 由New Brunswick Scientific Co.LTD USA 生产,工作体积1.2 L,溶解氧(DO)和 pH 由压缩 Air、N2、O2和CO24种气体控制,笼式搅拌桨由磁力驱动器驱动。

1.2 方法

1.2.1 静置培养 PK-15细胞生长至3 d～4 d后,细胞基本铺满方瓶时,先用含0.2 g/L EDTA的PBS清洗 2次,再加入2.5 g/L胰酶溶液消化,倾去胰酶,加低糖DMEM培养基,吹打,T-50方瓶以1∶3～1∶4的比率传代。

1.2.2 微载体系统培养 CT-3微载体,经无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液浸泡,1.055 kg/cm2高压蒸汽灭菌30 min,再浸泡在含100 mL/L新生小牛血清的低糖DMEM 培养基中,置37℃、体积分数为5%CO2培养箱过夜,待用。加入适量微载体和细胞于250 mL转瓶中,工作体积100 mL,采用间隙换液的培养方式,于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养,转速度第1天为30 r/min,此后均为40 r/min～45 r/min。对影响PK-15细胞在微载体快速均匀贴壁的培养基、接种细胞接种密度、微载体浓度等条件进行优化比较。

1.2.2.1 培养基对细胞生长的影响 在3 mg/mL微载体浓度条件下、接种密度25×104cells/mL,观察含 100 mL/L NBS的 MEM、高糖 DMEM(DMEM-HG)100 mL/L NBS和低糖 DMEM(DMEM-LG)100 mL/L NBS培养基对细胞生长的影响。

1.2.2.2 细胞接种密度对细胞生长的影响 在微载体浓度 5 mg/mL、培养液低糖 DMEM+100 mL/L NBS条件下,从48 h开始,每12 h换液50%,观察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的细胞接种密度对细胞生长的影响。

1.2.2.3 微载体浓度对细胞生长的影响 在优化细胞接种密度的基础上,在培养液低糖DMEM+100 mL/L NBS、接种密度5×104cells/mg条件下,自48 h开始,每 12 h换液 50%,观察 3、5、10 mg/mL微载体浓度对细胞生长的影响。

1.2.3 生物反应器培养PK-15细胞 安装好反应器和管路后,分别用pH为4.00和6.86的标准pH溶液在25℃下标定pH电极。在罐体内加入PBS液,1.055 kg/cm2高压蒸汽灭菌45 min。冷却后安装到反应器控制系统上,连接好压缩Air、N2、O2和CO24种气体的气路管线,校正DO电极后,将罐内PBS压出,工作体积1.2 L,加入适量微载体和种子细胞,控制溶氧(DO)为40%空气饱和度,搅拌速度为40 r/min～55 r/min,温度为37℃,pH 7.0。笼式搅拌桨由磁力驱动器驱动。

1.2.4 活细胞计数 方瓶中的单层细胞经胰酶消化、重悬后,直接用血细胞计数板计数;微载体上的细胞先用PBS漂洗2次,用含10 g/L结晶紫的柠檬酸溶液染色,用血细胞计数板计数细胞核。

2 结果

2.1 静置法培养PK-15细胞的生长

在方瓶中PK-15细胞的最高密度达到1.78×106cells/mL,细胞扩增了3.6倍。对数生长期的平均细胞比生长速率约为每天0.59,最高比生长速率为每天0.74。

2.2 不同培养基对PK-15细胞生长的影响

由表1可知,在3 mg/mL微载体浓度条件下、接种密度25×104cells/mL,采用低糖DMEM 培养基培养PK-15细胞所能达到最终细胞密度为1.8×106cells/mL,比 MEM 高30%,比高 糖DMEM 高22%。

表1 不同培养基对PK-15细胞生长的影响Table 1 Effect of different media on g rowth of on PK-15 cells

2.3 不同细胞接种密度对PK-15细胞生长的影响

由表2可知,在培养液低糖DMEM+100 mL/L NBS、5 mg/mL的相同微载体浓度下,PK-15细胞接种密度为4.5×104cells/mg MC和8.7×104cells/mg MC时,所能达到的最高细胞密度分别为2.90×106cells/mL和3.74×106cells/mL,扩增倍数分别为12.1和 8.6倍。

表2 不同细胞接种密度对PK-15细胞生长的影响Table 2 Effect of densities of cells inoculated on growth of PK-15 cells

2.4 不同微载体浓度对PK-15细胞生长的影响

由表 3可知,在培养液低糖 DMEM+100 mL/L NBS、接种密度5×104cells/mg条件下,随着微载体浓度提高,细胞密度也相应提高。用相同的表面积细胞密度接种,3、5、10 mg/mL微载体浓度所能达到的最高细胞密度分别为1.67×106、3.14×106、5.91×106cells/mL。

表3 不同微载体浓度对PK-15细胞生长的影响Table 3 Effect of microcarrier concentrations on growth of PK-15 cells

2.5 不同规格生物反应器培养PK-15细胞的生长

由表4可知,在低糖-DMEM、5 g/L微载体浓度和5×104cells/mg MC细胞接种密度条件下进行1 L和5 L生物反应器中PK-15细胞培养,在接种后第5天达到最高细胞密度分别为3.25×106cells/mL和3.36×106cells/mL,细胞扩增了13倍,差异不显著。

表4 不同规格生物反应器培养PK-15细胞的生长情况Table 4 Grow th of PK-15 cells in different bioreacto r

3 讨论

本试验比较了 MEM、高糖 DMEM和低糖DMEM 培养基对细胞生长的影响,结果发现,采用低糖DMEM培养基培养PK-15细胞所能达到最终细胞密度为1.8×106/mL,比MEM 高30%,比高糖DMEM高22%。代谢分析表明,低糖DMEM中葡萄糖利用率明显比高糖DMEM高,这是因为更多的葡萄糖转化为细胞生长提供能量和物质来源[10],而在高糖培养环境中,代谢过程中所多余的葡萄糖生成乳酸是其他培养液的 5倍[11],氨离子浓度最低,因此在长时间(36 h以上)培养时,应采用间歇换液的方式,以消除代谢产物给细胞生长带来的不利影响[12-13]。这正是低糖DMEM和高糖DMEM培养基引起细胞生长和最高细胞密度出现差异的根本原因。

研究表明,PK-15细胞生长与细胞表面积接种无相关性。当接种密度为为4.5×104cells/mg MC和8.7×104cells/mg MC时,最高细胞密度并没有因细胞接种密度的翻倍而成倍的增加,仅增加了28%。高密度接种时,细胞更容易进入对数生长期,但高密度接种的细胞受到的接触抑制作用程度比低密度接种的更强,使得细胞比生长速率较快下降。因此,PK-15细胞培养过程中为使培养过程能保持较高的细胞比生长速率,并获得更高的细胞扩增倍数,提高培养过程的效率,同时可以减少种子细胞的制备量。以4.5×104cells/mg MC左右为宜。

随着微载体浓度增加,最高细胞密度也相应增加,3、5、10 mg/mL 的载体,其面积比为1∶1.7∶3.3,但相应的细胞密度比却为1∶1.8∶3.6,说明微载体浓度与 PK-15细胞密度仅有一定程度的相关性。微载体浓度越高,细胞生长期越长,采用10 mg/mL微载体培养至第6天才达到最高细胞密度,高浓度微载体的表面积未能充分被利用。为了更快更经济地获得较高密度的健康细胞,在大规模培养 PK-15细胞时,应选择5 mg/mL的微载体浓度。

应用生物反应器系统和微载体技术培养PK-15细胞,在细胞密度、扩增倍数、比生长速率等方面均优于静置和转瓶培养。

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Optimization of Condition for Culture of PK-15 Cell by Microcarrier

HE Xi-zhong1,LI Chun-hua1,NI Jian-ping2,JIAG Feng-ying1,ZOU Yong1

(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai,201106,China;2.Shanghai J iamu Biological Production Co.,L TD,Shanghai,201106,China)

The aim of this study is to optimize the cultural condition of PK-15 cell by microcarrier system.On the condition of 5 mg/mL microcarrier concentration and low sugar DMEM containing 100 mL/L NBS as culture fluid,the effects on PK-15 cell growth at 4.5×104cells/mL and 8.7×104cells/mL inoculation density were observed.On the condition of low sugar DMEM containing 100 mL/L NBS as culture fluid and the 5×104cells/mg inoculation density,the effects on PK-15 cell growth at 3,5,10 mg/mL microcarrier concentration were observed.On the condition of 3mg/mL microcarrier concentration and the 25×104cells/mL inoculations density,the effects on PK-15 cell grow th by using MEM,high sugar DMEM or low sugar DMEM as culture fluid were observed.The results showed that the optimal culture conditions were 4.5×104cells/mg inoculation density,5 mg/mL microcarrier concentration,and low sugar DMEM as culture fluid.Optimal cultural technology could apply for the production of PK-15 cell.

microcarrier culture(MC);PK-15 cell;culture condition

Q813.11

A

1007-5038(2010)08-0020-04

2009-12-31

资金项目:上海市科委科技发展基金项目(04391930)

何锡忠(1966-),男,上海人,兽医师,硕士,主要从事兽用疫苗研究。*通讯作者