高效毛细管电泳法测定新疆紫草中左旋紫草素的含量

白 研，毋福海，罗碧莲，曾春丽

（广东药学院公共卫生学院，广州市 510310）

紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma.(Royle)Johnst.或内蒙紫草 Arnebia guttata Bunge的干燥根[1，2]。前者习称“软紫草”，后者习称“硬紫草”。其中新疆紫草更为常用，其味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有凉血、活血、解毒透疹等功效。临床常用于治疗血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疱痒、阴道炎、婴儿皮疹、水火烫伤等，具有很强的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、保肝和调节免疫等作用[3]。紫草根部含有萘醌类色素，包括紫草素、乙酰紫草素、丙烯酰紫草素、异丁酰紫草素、β，β´-二甲基丙烯酰紫草素等多种色素成分，多以左旋紫草素的含量作为紫草提取物的检测标准。文献报道左旋紫草素的测定方法有薄层扫描法[4]、高效液相色谱法[5～7]等。以毛细管电泳法进行测定，相关报道[8]为采用高频电导检测器，而电化学检测普遍存在的弱点为重现性较差，以此作为药材的质量控制方法较为不利。本试验采用紫外检测器，通过改善一系列电泳条件，建立了对新疆紫草中左旋紫草素分离、测定的高效毛细管电泳（HPCE）法。

1 材料

1.1 仪器

CL1030型HPCE仪（北京彩陆科学仪器有限公司）；K-2501型紫外-可见检测器（德国诺尔公司）；HW-2000型色谱工作站（2.17版，南京千谱软件有限公司）；pHS-3C型精密酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）；DL-360型超声波清洗器（宁波市石浦海天电子仪器厂）。

1.2 试药

左旋紫草素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0769-9903）；新疆紫草药材购自北京同仁堂，经广东药学院中药学院孟江副教授鉴定为真品；所用试剂为优级纯或分析纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品贮备液 精密称取左旋紫草素对照品9.0 mg，加适量甲醇溶解后定容至25 mL，即得（360.0 μg·mL-1），4 ℃贮藏。临用时稀释成各浓度的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 精密称取适量干燥的紫草粉末，置于50 mL锥形瓶中，加甲醇25 mL，准确称量，超声30 min，放冷，补充甲醇至初始质量，摇匀，过滤，弃去初滤液，续滤液用0.45 μm滤膜过滤，即得。

2.2 电泳操作条件

采用未涂层弹性融硅石英毛细管（53 cm×50 μm ID，有效长度46 cm），运行电压14 kV，重力虹吸方式进样，高度25 cm，进样时间15 s，紫外检测波长516 nm。试验在恒温（25℃）、恒湿（60%）条件下进行。

毛细管在使用前，依次用二次蒸馏水冲洗10 min、0.1 mol·L-1NaOH溶液冲洗5 min、二次蒸馏水冲洗5 min、运行缓冲溶液冲洗10 min，所需电泳缓冲液均经过超声脱气20 min。在2次运行之间，用运行缓冲溶液冲洗2 min。

2.3 电泳条件的优化

2.3.1 缓冲溶液的选择 试验考察了Tris-盐酸（pH 7.0～9.0）、Tris-H3BO3（pH 7.5～9.0）、Na2HPO4-NaH2PO4（pH 6.6～7.8）、硼砂-HAc（pH 7.0～8.5）、H3BO3-三乙胺（pH 7.5～9.2）、H3BO3-二乙胺（pH 7.5～9.2）缓冲体系。此外，还检测了Tris-柠檬酸（pH 7.0～9.0）、H3BO3-硼 砂（pH 7.4～9.0）、H3BO3-NaCl-硼砂（pH 7.0～9.2）、硼砂-KH2PO4（pH 7.0～9.2）、硼砂-Na2CO3（pH 9.2～1.0）、硼砂（pH 9.2）对样品中左旋紫草素分离效果的影响。结果发现，在H3BO3-二乙胺和H3BO3-三乙胺缓冲体系中，左旋紫草素出峰相对较好。又比较H3BO3-二乙胺和H3BO3-三乙胺2种缓冲体系，发现在H3BO3-二乙胺缓冲体系中，背景噪声和拖尾因子较大；在H3BO3-三乙胺缓冲体系中，左旋紫草素与其衍生物的分离效果较好，基线平稳，故最终选用了H3BO3-三乙胺缓冲体系。

由于考虑到运行缓冲液的浓度及配比影响被测物的分离度与迁移时间，故试验中利用正交试验法考察了H3BO3与三乙胺不同浓度及配比对左旋紫草素及其衍生物分离情况的影响，得出2.0 mmol·L-1H3BO3+6.0 mmol·L-1三乙胺的缓冲体系分离效果最佳。

2.3.2 有机改性剂的选择 在电泳过程中，缓冲溶液中加入有机溶剂可以影响介质黏度、介电常数及双电层结构等，进而影响电渗流及迁移行为，达到调节选择性、改善分离度的目的[9]。试验中考察了乙醇、甲醇、丙二醇、丙酮、β-环糊精（β-CD）、十二烷基硫酸钠（SDS）等几种添加剂不同加入量对分离和检测的影响，发现缓冲溶液中加入β-CD时，可使左旋紫草素峰形变得尖锐，峰高、峰面积明显增大。比较加入不同浓度的β-CD对左旋紫草素分离的影响，发现加入5.0 mmol·L-1β-CD分离效果最好，其它几种添加剂对分离检测无改善。因此，后续试验选择添加 5.0 mmol·L-1β-CD 的 2.0 mmol·L-1H3BO3+6.0 mmol·L-1三乙胺缓冲体系（pH 8.9）作为电泳介质。

2.3.3 分离电压和进样时间的选择 试验考察了8.0～23.0 kV电压范围内样品的分离情况，综合考虑分离度、分离时间、峰展宽、灵敏度、噪声等因素，优化选择14 kV为分离电压。

进样时间决定了进样量的大小，时间太短会影响检测的灵敏度，时间太长又会影响分离效率和分离度。本试验以重力进样，进样高度为25 cm，在14 kV分离电压下，考察了进样时间对分离效果的影响，选择最佳进样时间为15 s。

在上述优化试验条件下的电泳图见图1。

图1 毛细管电泳图A.对照品；B.紫草；1.左旋紫草素；2.甲醇；3.未知物Fig 1 Capillary electrophoretogramA.control substance；B.A.euchroma；1.shikonin；2.methanol；3.unknown substances

2.4 精密度试验

在优化电泳条件下，分别取10.8、25.2 μg·mL-12种浓度的左旋紫草素对照品溶液，各重复进样6次，测定峰面积。结果，RSD分别为1.60%、1.63%，表明仪器精密度良好。

2.5 线性关系考察

取适量对照品贮备液，分别加甲醇稀释成含左旋紫草素7.2、10.8、14.4、18.0、21.6、25.2、28.8、36.0 μg·mL-1的系列标准溶液，在优化电泳条件下重力进样测定。以对照品峰面积积分值（Y）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝578.24C－431.18（r＝0.9990）。结果表明，左旋紫草素检测浓度在7.2～36.0 μg·mL-1范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。

2.6 稳定性试验

精密称取紫草药材粉末0.9 g，加甲醇25 mL，按“2.1.2”项下方法处理后稀释2倍，分别在0、2、4、6、8、10、12 h按优化电泳条件分析测定。结果，RSD＝0.85%，表明供试品溶液在12 h内测定结果稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取0.050 g紫草药材粉末6份，将左旋紫草素对照品按3种水平分别加入紫草样品中，各平行2份，按“2.1.2”项下方法处理后在优化电泳条件下进样分析，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 样品含量测定

精密称取适量紫草粉末，平行6份，以甲醇为溶剂，液料比为50∶1，室温下超声30 min，按照“2.1.2”项下方法分别制备供试品溶液，在优化电泳条件下分别测定。结果，样品中左旋紫草素的平均含量为3.85 mg·g-1，RSD＝2.32%。

3 讨论

本试验以紫外检测器建立了测定左旋紫草素的HPCE法。通过对缓冲溶液组成、pH值、浓度、添加有机改性剂以及分离电压和进样时间对左旋紫草素与其衍生物分离情况的影响研究，确立了实现左旋紫草素与其衍生物有效分离的HPCE条件。在此条件下，左旋紫草素保留时间约为5 min，与相关文献[8]比较分离时间缩短。

试验中供试品溶液是以甲醇为溶剂、超声提取紫草样品而得，经正交试验优化左旋紫草素提取工艺条件，在此条件下左旋紫草素含量为3.85 mg·g-1，与相关文献[10]比较测定含量相符，但本试验以甲醇为溶剂提取左旋紫草素使收率有一定提高。

[1]唐汉均，王春丽.麻油提取紫草工艺条件优选[J].上海中医药杂志，2005，39（11）：58.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：238.

[3]李晓瑾，谭秀芳，马 媛，等.药用植物紫草的研究进展[J].新疆师范大学学报，2005，24（4）：69.

[4]刘 芳，王小平，伍伟祯.薄层扫描法测定烧伤膏中左旋紫草素的含量[J].基层中药杂志，2001，15（2）：21.

[5]Yani Hu，Zhihong Jiang，Kelvin Sze-Yin Leung，et al.Simultaneous determination of naphthoquinone derivatives in Boraginaceous herbs by high-performance liquid chr-omatography[J].Analytica Chimica Acta，2006，577：26.

[6]郭红军，简丽娜，孔焕宇，等.高效液相色谱法测定玉红膏中紫草素的含量[J].时珍国医国药，2006，17（4）：489.

[7]许红兰，姜 哲.HPLC法测定复方紫草油中左旋紫草素的含量[J].现代医药卫生，2008，24（21）：3211.

[8]李全文，陈缵光，周 勰，等.毛细管电泳法测定紫草中的紫草素[J].分析化学，2006，34（7）：991.

[9]明永飞，孙玉希，尤进茂.氨基酸衍生物在毛细管区带电泳下的分离研究[J].化学研究，2003，14（3）：9.

[10]白 研，宋粉云，毋福海，等.正交试验优选紫草提取工艺[J].中药新药与临床药理，2006，17（4）：288.