Twist和基质金属蛋白酶 -2在乳腺浸润性导管癌组织中的表达分析

裴素霞,齐贵胜

研究显示,转录因子 Twist、基质金属蛋白酶 (MMP)-2通过不同的途径在肿瘤发生、发展和转移等方面起着重要的作用[1-2]。本研究采用免疫组织化学法检测乳腺浸润性导管癌组织中 Twist、MMP-2的表达,探讨两者在乳腺浸润性导管癌浸润、转移过程中的作用及其相互关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 聊城市人民医院病理科存档的 2008年 1月—2009年 12月外检乳腺浸润性导管癌组织标本蜡块 68例 (患者术前均未经放疗、化疗及激素治疗),均为女性病例,年龄32～75岁,平均 51.04岁。患者年龄≤50岁者 31例, ＞50岁者 37例;肿块直径≤2 cm者 32例,2～5 cm者 20例,≥5 cm者 16例;伴有腋窝淋巴结转移者 31例,无腋窝淋巴结转移者37例;根据 Elson and Ellis半定量分级法进行组织学分级:Ⅰ级 23例,Ⅱ级 32例,Ⅲ级 13例。20例乳腺良性病变 (乳腺纤维腺瘤)为对照组。病理诊断经两位病理学专家复核证实。

1.2 试剂 Twist鼠抗人单克隆抗体为 Santa Cruz公司产品(工作浓度为 1:200);鼠抗人 MMP-2单克隆抗体 (即用型),免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司,操作步骤按说明书进行。

1.3 方法 所有标本均经 10%中性甲醛溶液固定,常规脱水,石蜡包埋。将每一例蜡块作 4μm厚的连续切片,免疫组化采用 Elivision Plus法检测标本组织中的 Twist和 MMP-2表达。用已知的阳性切片作为阳性对照,用 PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断标准 Twist、MMP-2主要表达于细胞质中,以细胞质呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。参照文献 [3-4]以半定量判断 Twist、MMP-2免疫组化结果:光镜下随机观察免疫组化染色切片 5个高倍镜视野,每个视野分别计算 200个细胞,共计数 1 000个细胞。从两方面对其进行评分:按阳性着色程度评分,0分为无着色;1分为浅黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色。再按阳性细胞所占比例评分:0分为阴性;1分为 ＜10%;2分为 11% ～50%;3分为 51%～75%;4分为 ＞75%。以两者乘积判定结果:4～l2分定为阳性,4分以下定为阴性。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 11.5软件包进行统计学处理,组间比较采用 χ2检验;Twist、MMP-2表达的相关分析采用非参数相关性 Spearman检验,显著性水准 α=0.05。

2 结果

2.1 Twist、MMP-2蛋白在乳腺浸润性导管癌组织和乳腺纤维腺瘤组织中的表达比较 Twist、MMP-2蛋白在乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率为 55.88%、73.53%,明显高于其在乳腺纤维腺瘤中阳性表达率 15%、35%,差异有统计学意义(χ2值分别为 10.380和 10.055,P＜0.01,见表 1)。

表1 乳腺浸润性导管癌及乳腺纤维腺瘤组织中 Twist和MMP-2的阳性表达Table 1 The positive expression of Twist and MMP-2 in IDCand fibroadenoma

2.2 Twist、MMP-2表达水平与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系 腋窝淋巴结转移与未转移、不同组织学分级乳腺浸润性导管癌组织 Twist阳性表达率和 MMP-2阳性表达率间差异均有统计学意义 (P＜0.05);不同年龄患者、不同直径肿瘤乳腺浸润性导管癌组织中 Twist、MMP-2阳性率间差异无统计学意义 (P＞0.05,见表 2)。

表2 不同临床病理指标乳腺浸润性导管癌组织中 Twist、MMP-2阳性率表达比较Table 2 Comparison of the positive expression rates of Twist and MMP-2 in IDCwith different clinical-pathological features

2.3 乳腺浸润性导管癌组织中 Twist、MMP-2表达的相关性68例乳腺浸润性导管癌组织中 Twist和 MMP-2同时阳性表达 32例,占 47.06%(32/68);Twist和 MMP-2同时阴性表达 12例,占 17.65%(12/68)。经统计学 Spearman检验,Twist表达与 MMP-2表达呈正相关 (r=0.272,P＜0.05,见表3)。

3 讨论

Twist作为果蝇、鼠、人等生物体内的一种碱性螺旋一环一螺旋转录因子,在胚胎生长发育阶段诱导细胞迁移的调控过程中起着关键作用。研究发现 Twist具有癌基因的特征,能编码凋亡抑制蛋白,通过作用于 p53依赖性和非依赖性通路、N-Myc通路以及 NF-KB通路发挥抗凋亡作用[5-7],Twist还可通过对 Akt途径的正性调控作用抑制凋亡[8];Twist在转录水平上通过影响 E-box启动子的表达,诱导上皮细胞 -间叶细胞转变 (EMT)的形成[9],从而抑制 E-cadherin转录,使由 E-cadherin所调控的细胞粘附作用失效,促进肿瘤细胞从原发灶上脱落,侵入周围组织[10];Twist上调可增强 VEGF表达,促进血管生成,并提高染色体的不稳定性,促进肿瘤侵袭转移[11]。Yang等[12]用裸鼠的乳腺浸润性导管癌模型显示,Twist高表达的乳腺浸润性导管癌细胞系易发生转移,Twist对癌细胞的血管内渗和肺转移起重要作用。本实验发现乳腺浸润性导管癌组织中 Twist的阳性表达率为 56%,明显高于对照组的 15%;Twist的阳性表达与患者的腋窝淋巴结转移、组织学分级有关,发生腋窝淋巴结转移和组织学分级较高的乳腺浸润性导管癌组织中 Twist的阳性表达率明显增高,与蔡凤林等[13]研究结果一致,提示 Twist参与了乳腺浸润性导管癌的发生、发展。

表3 乳腺浸润性导管癌组织中 Twist、MMP-2表达相关性Table 3 Correlation between the expression of Twist and MMP-2 in IDC

细胞外基质的降解和基底膜的破坏是肿瘤浸润和转移的先决条件,其中 MMPs与肿瘤关系最为密切。MMPs是一组依赖于锌离子的能降解细胞外基质的内肽酶家族,能够降解细胞外基质,促进肿瘤的侵袭与转移。MMP-2是金属蛋白酶家族中与肿瘤关系最为密切的因子之一。MMP-2是一种锌离子依赖的蛋白水解酶,由肿瘤细胞和间质细胞以酶原形式分泌,经水解后激活,能特异性地降解基底膜的主要成分:Ⅳ型胶原,还可降解 V、Ⅵ、X型胶原、FN和明胶,同时通过对细胞外基质的改建,促进肿瘤新生血管的形成,促进肿瘤的侵袭和转移[14]。Tester等[15]通过基因转染,将 pro-MMP-2基因转入人乳腺浸润性导管癌 MDA-MB-231细胞株中,发现转基因后的肿瘤细胞侵袭能力明显增加。冯悦年[16]采用免疫组化 SP法检测 65例乳腺浸润性导管癌组织中 MMP-2的表达,结果显示:MMP-2表达与乳腺浸润性导管癌病理学分级和淋巴结转移有关,而与患者年龄、肿瘤大小无关,MMP-2高表达者生存率明显降低。本实验发现乳腺浸润性导管癌组织中 MMP-2的阳性表达率为 74%,明显高于对照组 35%。MMP-2的阳性表达与患者的腋窝淋巴结转移、组织学分级有关,与患者年龄及肿瘤大小无关,与文献报道相似[17],说明 MMP-2参与了乳腺浸润性导管癌的浸润和转移,并与肿瘤的恶性程度相关。

顾纪明等[18]研究 48例结直肠癌组织中的 Twist和 MMP-2的表达,结果标明 Twist和 MMP-2的表达有关。杨静等[19]采用 RNA干扰技术在小鼠乳腺浸润性导管癌细胞株 4T1中沉默 Twist的表达,通过全基因组基因芯片技术检测了 Twist沉默前后 4T1细胞基因表达谱的差异性,结果显示 Timp-2(MMP2的抑制剂)被上调,认为在乳腺浸润性导管癌发展中,Twist很可能通过调节 MMP-2来降解在侵袭和转移中遇到的一系列组织屏障从而促进肿瘤转移。本研究 68例乳腺浸润性导管癌组织中 Twist和 MMP-2同时阳性表达 32例,占47.06%(32/68);Twist和 MMP-2同时阴性表达 12例,占17.65%(12/68),经统计学分析 Twist表达与 MMP-2表达呈正相关,提示 Twist、MMP-2共同参与了乳腺浸润性导管癌的发生、发展和浸润转移,Twist可能通过上调 MMP-2的表达,促进细胞外基质降解,成为其促进乳腺浸润性导管癌浸润、转移的因素之一。

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