不同稀释液对血清中HBsAg定量测定的影响

(南京大学医学院附属南京鼓楼医院检验科，江苏南京 210028)

我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染的高发区，HBV感染的诊断主要依赖于患者血清中病毒标志物和病毒核酸(HBV DNA)的检出。乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是HBV表面的外膜蛋白，由病毒S基因编码，在病毒感染肝细胞过程中起重要作用。最近一些研究证明HB-sAg 和 HBV DNA 水平之间有良好的相关性［1－2］，定量检测血清中HBsAg可以反映宿主体内HBV DNA的水平，对评价抗病毒药物治疗的疗效和判断预后有重要意义［3］，同时对于一些HBV DNA呈阴性的慢性乙肝患者，血清中HBsAg的含量就为临床医生的诊断及治疗提供了良好的依据。目前，我院采用ARCHITECT i2000SR化学发光分析仪对血清中的HBsAg进行定量检测。临床上有些乙肝患者HBsAg定量测定结果超出该仪器所能检测的线性范围，为了得到准确、可靠的实验结果，帮助临床医生更好地了解疾病进展，常需要对高浓度HBsAg血清进行稀释后再测定。

1 材料和方法

1．1 血清标本

筛选收集乙肝患者血清 HBsAg定量＞250 IU·ml－1的标本血清，标本来源于南京市鼓楼医院门诊。标本要求无明显溶血、脂血。

1．2 混合低值血清制备

收集本院住院病人中乙肝两对半定量结果全阴性的血清标本，混匀后2 000 r·min－1离心取其上清液(经检测 HBsAg 为 0．02 IU·ml－1)。

1．3 仪器与试剂

美国雅培公司生产的ARCHITECT i2000SR全自动化学发光仪及配套试剂(含HBsAg专用稀释液)、生理盐水、蒸馏水、自制混合低值血清等。

1．4 实验方法

将不同患者的高浓度 HBsAg血清(＞250 IU·ml－1)分别用专用稀释液、生理盐水、混合低值血清及蒸馏水按照1∶100的比例(5 μl血清加入495 μl稀释液)稀释，充分混匀后取双份上机检测HBsAg含量。操作步骤严格按说明书进行，测定在1 h内完成。

1．5 统计方法

用Microsoft Excel系统对数据进行分析，组间比较用配对t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

高值HBsAg血清标本分别用HBsAg专用稀释液、生理盐水、混合低值血清及蒸馏水按照1∶100比例稀释后经ARCHITECT i2000SR化学发光仪测HBsAg浓度值，结果见表1。

表1 高浓度HBsAg用不同稀释液稀释后的测定结果及偏差Tab 1 The results of concentration of HBsAg diluted with different diluents

生理盐水和蒸馏水作为稀释液后的测定值与专用稀释液稀释后的测定值相比，P＜0．05，有统计学差异，所以在日常检测中，不能用生理盐水或蒸馏水作为化学发光免疫分析法测定HBsAg的稀释液;而混合低值血清稀释后的测定值与专用稀释液相比偏差较小，P＞0．05，差异无统计学意义，故混合低值血清可以作为替代稀释液用于化学发光免疫分析法测定HBsAg。

3 讨 论

雅培ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析仪核心技术为化学发光微粒子免疫分析(chemiluminesent micropaticle immunoassay)，以吖叮酯作为标记发光剂，主要用于测定蛋白质、病毒抗原等大分子物质，试剂具有极高的灵敏度、特异性和稳定性。它对HBsAg的可测范围是0～250 IU·ml－1，而临床上有些血清的HB-sAg往往超出了该检测范围，所以需要稀释后再测定，但是由厂家提供的专用稀释液价格相当昂贵且保存有效期很短，有时会有供货不及时或稀释液超过有效期的情况发生。本研究通过用生理盐水、混合低值血清、蒸馏水作为稀释液来稀释高浓度的HBsAg血清，旨在探讨三者对血清HBsAg测定的影响，以期选择出合适的稀释液来代替专用稀释液。免疫反应体系中的蛋白分子种类及含量、pH值、离子强度对免疫反应本身有较大影响。待测血清经稀释后如果反应体系发生明显变化，则会影响检验结果的准确性［4］。

通过这3种稀释液分别对11份不同乙肝患者血清稀释后进行测定，比较偏差计算结果发现用生理盐水及蒸馏水稀释后测得的结果都偏高，均存在明显偏差，分别为 －2．05% ～157．81%、－16．32% ～313．64%，而用混合低值血清稀释后的偏差为－35．03% ～32．60%，与专用稀释液稀释后测定值比较，差异无统计学意义。可能因为低值混合血清的蛋白质、pH值、离子强度和其他血清成分与样本血清基本相近，因此其测定结果偏差最小。因只对较高浓度HBsAg的血清标本(一般＞250 IU·ml－1)进行稀释，所以用混合低值血清稀释测定的偏差并不影响对HBsAg定量结果的阴阳性判定，仅对其高浓度的值有所影响，而这个结果应该是可以接受的。生理盐水的离子强度、pH值与血清相近，但缺乏蛋白质和血清成分，所以测定结果偏差较大。而蒸馏水与血清相比在蛋白质、pH值方面均相差较大，不适宜作为免疫反应的血清稀释液，这与丁忠旗等［5－7］研究结果一致。考虑到胎牛血清在离子强度、pH值方面与人血清接近，另选取5份高浓度HBsAg的血清标本稀释后进行比较，发现与专用稀释液比较偏差亦较大，可超过100%(结果未在表1中列出)，可能是胎牛血清中所含蛋白种类和人血清相比有一定差异，对整个反应体系有影响所致。

本实验结果表明，雅培ARCHITECT i2000SR全自动免疫分析仪在测定HBsAg浓度时，如遇到超出仪器线性范围(＞250 IU·ml－1)的标本需进行稀释，除专用稀释液外，低值血清可以作为替代稀释液使用，以测定高浓度HBsAg的实际值来观察患者病情及转归。

［1］孙长义，王山梅．乙肝病毒标志物与PCR-HBV定量水平的关系［J］．中国公共卫生，2002，18(12):1480-1481．

［2］侯远沛，宋丽．乙型肝炎标志物定量检测结果与HBV-DNA含量相关性分析［J］．实用医技杂志，2004，11(10):2112-2113．

［3］陈祥胜，廖雯君．乙肝HBsAg定量检测的临床诊断意义［J］．湖北中医学院学报，2009，11(2):21-23．

［4］高云朝，杨亚东，陆汉魁．稀释介质对化学发光免疫分析检测血清HCG的影响［J］．标记免疫分析与临床，2007，14(2):121，72．

［5］丁忠旗，李永培，盛强．不同稀释液对高浓度HCG测定值的影响［J］．中华核医学杂志，2002，22(1):39．

［6］朱诚忆，胡建军．不同稀释液对RIA测定高浓度AFP的影响［J］．上海医学检验杂志，2000，15(3):140．

［7］陈春华．探讨用不同稀释液对RIA测定高浓度AFP的影响［J］．华西医学，2003，18(2):247．