细菌蛋白多糖对大鼠免疫功能的影响

路则庆 羊雪芹 靳明亮 曹 煜 汪以真*

（1.浙江大学饲料科学研究所,生物饲料安全与污染防控国家工程实验室,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州 310029; 2.杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州 310036）

细菌多糖具有无毒高效、理化性质独特、易于分离等优良特性,并且可通过深层发酵实现工业化生产[1-2],另外,细菌多糖生产周期短,不易受季节、地域和病虫害等自然环境的限制[3],因此具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。多糖作为在生命活动中起核心作用的基本物质,具有控制细胞分裂和分化,调节细胞生长与衰老等复杂生物功能。同时,作为一种免疫调节剂,多糖能激活巨噬细胞,活化并促进T淋巴细胞转化,提高B淋巴细胞和NK细胞的数量与活性[4];此外,多糖还具有诱导白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素等细胞因子的产生及其受体的表达,活化补体系统的经典途径和变更途径等作用[5]。

目前国内报道具有免疫调节活性或抗肿瘤作用的多糖主要有灵芝多糖、香菇多糖、黄芪多糖、银耳多糖和金针菇多糖等,对细菌多糖的研究还不够深入。本试验通过探讨Z 0206细菌蛋白多糖对大鼠免疫功能的调节作用,为其进一步在畜禽上推广应用提供理论依据,对推动安全、高效的畜禽免疫增强剂的研制具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 材料

Z 0206细菌蛋白多糖由本实验室筛选的产多糖菌株E.cloacaeZ 0206发酵培养,发酵产物经过离心除菌体、乙醇沉淀、乙醚丙酮洗涤等分离纯化过程制备而成[6]。其中糖含量为35.05%,多糖主要成分由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成,摩尔比分别为6.860︰0.455︰1.180,平均分子量为23 928 u,包含α和β2种糖苷键,存在吡喃糖环构型[7]。

血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）检测试剂盒,补体单体成分C3、C4检测试剂盒,溶菌酶检测试剂盒,TNF-α、IL-2和IL-6放射免疫分析试剂盒,均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

将40只清洁级SD大鼠随机分为4组,每组10只（雌雄各占1/2）。其中1组为对照组,饲喂基础饲粮,其余为试验组,分别在基础饲粮中添加0.2%、0.4%和0.8%的Z 0206细菌蛋白多糖。试验基础饲粮参照试验动物饲粮配方AIN-93G（Nutrient Requirem entof Laboratory Animal,Fourth Revised Edition,1995）配制而成,配制的饲粮经Co60放射杀菌密封低温保存。

1.2.2 饲养管理

试验大鼠在温度20～25℃,相对湿度40%～70%的隔离环境中饲养,自由采食、饮水,预试期5 d,正试期28 d。饲养试验结束后,大鼠禁食（自由饮水）12 h,眼眶静脉丛采血,颈椎脱臼处死,取样检测相关免疫指标。

1.2.3 检测指标及方法

免疫器官指数:试验结束时,先称量大鼠的活体重,大鼠颈椎脱臼处死后无菌摘取脾脏和胸腺,用滤纸吸去血液,用眼科剪剪去脂肪和系膜后称重,计算脾脏指数和胸腺指数[8-9]。

免疫器官指数（g/kg）=免疫器官重（g）/体重（kg）。

部分血清免疫指标:大鼠眼眶静脉丛采血于无菌离心管中,于37℃水浴中静置,上层血清析出后, 3 000 r/min离心10m in,吸取上清,分装于Eppendorf管保存于-70℃低温冰箱,测定血清免疫指标。血清IgA、IgG和IgM,血清C3、C4含量采用免疫比浊法在Daytona全自动生化分析仪上测定;血清溶菌酶活性采用比浊法在Pharmacia Biotech分光光度计上测定;血清细胞因子TNF-α、IL-2和IL-6含量采用放射免疫法在西安262厂XH 6080放免仪上测定。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析,组内和组间比较采用单因素方差分析,结果以平均值±标准差表示,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 细菌蛋白多糖对大鼠免疫器官指数的影响

由表1可知,与对照组相比,饲粮中添加0.4%和0.8%的Z0206细菌蛋白多糖显著提高了大鼠脾脏和胸腺指数（P＜0.01）,2个试验组间差异不显著（P＞0.05）,而0.2%添加组大鼠免疫器官指数无明显改善（P＞0.05）。

表1 Z0206细菌蛋白多糖对大鼠免疫器官指数的影响Table 1 Effect of p roteoglycan Z0206 on immune organ indices in rats g/kg

2.2 细菌蛋白多糖对大鼠血清免疫球蛋白含量的影响

由表2可知,饲粮中添加不同剂量的Z 0206细菌蛋白多糖可提高大鼠血清免疫球蛋白含量。与对照组相比,0.2%、0.4%和0.8%添加组大鼠血清IgA含量分别提高了22.9%（P＜0.01）、41.3% （P＜0.01）和13.8%（P＜0.05）;血清IgM含量分别提高5.4%（P＜0.05）、10.8%（P＜0.05）和5.4%（P＜0.05）;而血清IgG含量只有0.4%添加组显著提高（P＜0.05）。

表2 Z0206细菌蛋白多糖对大鼠血清免疫球蛋白含量的影响Table 2 Ef fect of proteoglycan Z0206 on concentrations of serum immune globulins in rats g/L

2.3 细菌蛋白多糖对大鼠血清C3、C4含量和溶菌酶活性的影响

由表3可见,与对照组相比,各试验组大鼠血清C3含量均显著提高（P＜0.05）,血清C4含量也有提高的趋势,但差异不显著（P＞0.05）;0.2%、 0.4%和0.8%添加组大鼠血清溶菌酶活性分别提高了64.0%（P＜0.01）、99.3%（P＜0.01）和64.4%（P＜0.01）,其中,0.4%添加组大鼠血清溶菌酶活性显著高于其他各试验组（P＜0.01）。

表3 Z0206细菌蛋白多糖对大鼠血清C3、C4含量和溶菌酶活性的影响Tab le 3 Effect o f proteog lycan Z0206 on C3,C4 concentration and lysozyme ac tivity in serum of rats

2.4 细菌蛋白多糖对大鼠血清细胞因子含量的影响

由表4可见,饲粮中添加不同剂量的Z 0206细菌蛋白多糖对大鼠血清细胞因子分泌有促进作用。与对照组相比,各试验组大鼠血清IL-2含量分别提高了87.4%（P＜0.01）、89.2%（P＜0.01）和22.7%（P＞0.05）;血清IL-6含量分别提高了39.4%（P＜0.01）、48.1%（P＜0.01）和37.5% （P＜0.01）;此外,0.2%和0.4%添加组大鼠血清TNF-α含量比对照组提高了132.3%（P＜0.01）和208.2%（P＜0.01）。

表4 Z0206细菌蛋白多糖对大鼠血清中细胞因子含量的影响Table 4 Effect of proteoglycan Z0206 on concentration of serum cytokines in rats

3 讨 论

3.1 细菌蛋白多糖对大鼠免疫器官指数的影响

多糖分子通过活性中心与细胞表面的多糖受体结合进入细胞,并且聚集在脾脏等器官[10]。羊雪芹等[11]研究发现,Z 0206细菌富硒多糖可以显著提高小鼠的脾脏和胸腺指数。帅学宏等[12]的研究发现鬼臼多糖对小鼠脾脏和胸腺指数亦有显著的提高作用。本研究结果表明,Z0206细菌蛋白多糖可以提高大鼠脾脏和胸腺指数,与上述研究结果一致,其中0.4%和0.8%添加组大鼠脾脏和胸腺指数显著提高。

3.2 细菌蛋白多糖对大鼠血清免疫球蛋白含量的影响

免疫球蛋白是机体内存在的一类广泛参与体液免疫反应的球蛋白,具有抗菌、抗病毒、激活补体等生物学功能。Li等[13]探讨了米糠多糖对雏鸡免疫功能的影响,结果发现米糠多糖能促进雏鸡血清免疫球蛋白IgA、IgG和IgM的含量;胡晓蕾等[14]的研究发现,在SD大鼠的饲粮中添加不同浓度的白术多糖,能提高其血清免疫球蛋白水平。本研究也发现,SD大鼠饲粮中添加Z 0206细菌蛋白多糖能增加血清IgA、IgG和IgM的含量,其中以0.4%添加组效果最为显著。

3.3 细菌蛋白多糖对大鼠血清C3、C4含量和溶菌酶活性的影响

补体是特异性免疫的组成成分,是一组不耐热具有酶活性的球蛋白,激活后具有细胞溶解、免疫调节、中和病毒等生物学效应。溶菌酶主要是由单核吞噬细胞释放,可作为吞噬系统功能的指标,吞噬细胞是免疫系统一类重要的辅助细胞,具有递呈抗原的作用。夏雪雁等[15]研究当归多糖活性时发现,给小鼠口服黄芪多糖可提高其补体C3含量;李同洲等[16]研究发现,在仔猪饲粮中添加450 mg/kg的香菇多糖对血清C4含量影响不显著;邓超等[17]探讨茶树菇多糖对小鼠免疫功能的影响时也发现,无论是菌丝体茶树菇多糖还是发酵液茶树菇多糖都能在一定程度上提高小鼠溶菌酶活性。本研究结果发现,添加Z0206细菌蛋白多糖对大鼠血清C3有显著提高作用,但对血清C4分泌没有显著促进效果,提示Z 0206细菌蛋白多糖是通过替代和经典2种途径来激活补体系统的,但对经典途径促进作用不明显;Z0206细菌蛋白多糖对大鼠血清溶菌酶活性有显著提高作用,其中0.4%添加组大鼠血清溶菌酶活性显著高于其他各处理。

3.4 细菌蛋白多糖对大鼠血清细胞因子含量的影响

细胞因子是由免疫细胞及相关细胞产生的一类多功能蛋白质多肽分子,包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子（TNF）等,主要介导和调节免疫应答及炎症反应,刺激造血功能,并参与组织修复等。陈清华等[18]探讨了牛膝多糖的免疫调节作用机制,结果发现,牛膝多糖可以促进仔猪血清细胞因子TNF、IL-1、IL-2和IL-6的分泌;牛晓晖等[19]给小鼠投喂云芝多糖,结果发现给药组小鼠细胞因子IL-1、IL-2、IFN-γ和TNF的含量有所提高,其中IL-2和IFN-γ的活力值明显高于空白对照,且呈良好的剂量依赖关系。本试验研究发现,当Z 0206细菌蛋白多糖添加量为0.2%和0.4%时,大鼠血清IL-2、IL-6和TNF-α的含量显著提高,虽然0.8%添加组上述细胞因子的分泌也有所增加,但相比于0.4%添加组反而有下降趋势。

4 结 论

①Z0206细菌蛋白多糖可以提高大鼠脾脏和胸腺指数,促进血清IgA、IgG和IgM的分泌,提高血清溶菌酶的活性,促进血清C3分泌,同时还可以提高血清细胞因子IL-2、IL-6和TNF-α的浓度。

②Z 0206细菌蛋白多糖对SD大鼠有一定的免疫调节作用,其中以0.4%添加量效果最为显著。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:yzw ang@zju.edu.cn

（编辑 王智航）