铜绿假单胞菌上清液诱导 J774细胞凋亡过程中凋亡诱导因子的表达

李 颖,柴文戍,刘 砚,宁学聪

(辽宁医学院附属第一医院,辽宁锦州 121001)

铜绿假单胞菌(PA)属革兰阴性条件致病菌,易感染烧伤或免疫力低下患者。研究证明,PA可通过依赖ATP、P2Z受体介导的细胞坏死或非依赖ATP、caspase介导的细胞凋亡诱导巨噬细胞死亡[1],同时伴有Bax表达增加和 Bcl-2表达降低,细胞色素 C释放增加以及 caspase3/9活化增加。因此推测,PA诱导巨噬细胞凋亡与线粒体途径有关。凋亡诱导因子 (A IF)是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白[2],具有很强的促凋亡活性。本研究通过观察 PA上清液诱导的 J774细胞凋亡以及 A IF在凋亡过程中的表达,探讨 PA感染宿主的发病机制,为临床治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 PA采用标准菌株 ATCC27853,辽宁医学院第一附属医院检验中心惠赠,用 LB培养基培养。J774巨噬细胞由中国医学科学院协和医科大学基础医学研究所提供。培养基采用含 10%FBS和 100 U/ml庆大霉素的高糖型DMEM。Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司,A IF抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司,其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细菌上清液制备 在 8 ml的大豆肉汤培养基中采用振颤法(37℃,8 h)对菌株进行培养,离心15 min,过滤,获得细菌上清液,56℃灭活 1 h,-20℃保存备用。

1.2.2 细菌上清液诱导细胞凋亡 将贴壁的 J774细胞常规胰蛋白酶消化传代,接种于培养瓶中,37℃、5%CO2培养箱中培养,隔 2 d换液 1次。待生长基本融合后,弃培养基,实验组加入 2 ml含胎牛血清、含细菌上清液、不含抗生素的DMEM培养基,对照组则加入 2 ml含胎牛血清、不含抗生素的DMEM培养基,37℃水浴中培养 3、6、9 h后分别进行细胞凋亡检测。

1.2.3 凋亡细胞检测 ①Gimsa染色:将培养后的细胞用 PBS冲洗,甲醇固定、干燥,G imsa染液染色15 min,冲洗,晾干,普通显微镜下观察。②荧光染色计数:将培养后的细胞用 Hoechst 33258染色,荧光显微镜下观察凋亡细胞核的形态。③Annexin-V FITC/PI双染分析:待检细胞用 Annexin-V FITC/PI双染,上流式细胞仪检测。每个样品至少计数 1× 105个细胞。④Western blot法测定 A IF含量:将培养后的细胞用 PBS冲洗,加入细胞裂解液提取细胞蛋白,离心收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。每份样品取 40μg进行 12%SDS-PAGE分析,湿式转移法转至 PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,加入一抗, 4℃振荡过夜,加入羊抗兔 Ig M作用 2 h,采用化学发光法检测。实验重复 3次。

1.3 统计学方法 应用 SPSS16.0软件,计量资料以表示,采用单因素方差分析进行统计学处理,两组比较采用 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gimsa染色 3 h组细胞膜完整,但出现发泡现象;6 h组出现凋亡细胞染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态;9 h组细胞出现皱缩、变圆,可见凋亡小体。随时间延长,各实验组凋亡细胞逐渐增多,对照组细胞则正常生长。

2.2 荧光染色 3 h组有少数细胞发生凋亡,随时间延长凋亡细胞数量逐渐增多,6、9 h组细胞皱缩,核密度增高,核断裂,可见凋亡小体,细胞染色质呈浓染的块状或颗粒状荧光,聚集于核周边或裂解成碎片。

2.3 Annexin-V FITC/PI双染分析 实验 3、6、9 h组的细胞凋亡率分别为 (15.76±1.13)%、(36.02 ±0.95)%、(55.45±2.42)%,对照组为 (2.68± 0.45)%。表明 PA上清液可诱导 J774细胞迅速发生凋亡,且凋亡率随时间延长明显升高,组间比较均有统计学差异(P均 ＜0.01)。

2.4 Western blot法测定 A IF含量 实验 3、6、9 h组A IF蛋白表达相对值分别为 0.39±0.013、0.59 ±0.023、0.72±0.020,对照组为 0.26±0.017。3 h组A IF开始出现低量表达,6、9 h组A IF表达更加明显,与对照组比较均有统计学差异(P均 ＜0.01)。

3 讨论

A IF具有氧化还原、电子传递和维持细胞正常生理活动功能,还含有线粒体定位信号和核定位信号序列,具有很强的促凋亡活性。然而,A IF是否参与了 PA上清液诱导巨噬细胞J774细胞凋亡的过程目前尚不清楚。本实验发现,PA上清液能诱导J774细胞发生凋亡,且随时间延长凋亡细胞数量增多。提示 PA以时间依赖方式诱导人 J774细胞凋亡,与国外研究一致[3]。

线粒体是真核细胞的重要细胞器,也是细胞凋亡调控的活动中心。凋亡诱导物诱导线粒体上的膜透过性转变孔开放,导致多种凋亡蛋白,如细胞色素C、A IF、caspase前体蛋白等,从线粒体膜间隙被释放到细胞质中,引起细胞凋亡[4,5],具有核定位信号序列的A IF被释放至细胞质后,便进入细胞核内。据报道,光敏疗法能引起细胞凋亡,通过细胞色素 C介导依赖 caspase和A IF介导非依赖 caspase两种途径,当第一个途径被阻止,则细胞凋亡依靠 A IF介导[6]。本研究通过Western blot法检测,发现在 PA上清液培养 J774细胞 3 h后 A IF开始出现低量表达,继续培养 6、9 h时 A IF蛋白表达更加明显。证明A IF蛋白与 PA上清液诱导J774细胞凋亡的过程有关。国外研究认为,A IF蛋白作为线粒体途径诱导细胞凋亡的诱导剂,拥有氧化还原酶区域,能够引起染色质的初步凝集和DNA大规模断片化,进而引发不依赖于 caspase的细胞凋亡[7,8]。

终上所述,PA诱导巨噬细胞凋亡可能与线粒体有关。实验证明,活化的 JNK和 p38能阻止A IF进入细胞核,从而阻止A IF诱导细胞凋亡。因此寻找抑制线粒体途径的药物治疗各种 PA相关性疾病有着良好的应用前景。

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