辛伐他汀抑制大鼠急性心肌梗死后炎症因子的实验研究

顾永林,庹 田

(广安市人民医院心内科,四川 广安 638000)

急性心肌梗死后交感神经系统过度激活,心肌细胞坏死、纤维化,心肌细胞及间质增生肥大、胶原沉积致心肌重塑与心功能异常,研究表明细胞分子在其中扮演重要角色[1,2]。抑制急性心肌梗塞后炎症因子表达,是改善或逆转心脏重塑、保护心血管功能的重要环节。他汀类降脂药具有降脂外的多种心脏保护作用[3,4],其可能是在分子水平上通过抑制细胞炎症因子表达而发挥效应机制,本实验旨在用辛伐他汀干预大鼠急性心肌梗死模型,观察其是否具有抑制急性心肌梗死后多种炎症因子表达、心肌胶原生成的作用,探讨是否有利于改善心室重塑和心功能,为临床利用辛伐他汀治疗急性心肌梗死提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂:辛伐他汀(20mg/片)默沙东公司赠送,羟脯氨酸测定试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。大鼠心肌组织TNF-α、IL-6和 IL-10 ELISA检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。实验操作、数据测量和分析均在重庆医科大学临床学院心血管实验室完成。

1.2 动物模型的建立及分组:参照文献的方法[5]:麻醉动物开胸,在左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部约 3mm处,结扎左冠状动脉前降支。体重200-250克的雄性 Wistar大鼠 24只(购于第三军医大学动物中心),随机分为 3组(n=8)分别为假手术组(S组),心肌梗死组(M组);心肌梗死 +辛伐他汀组(X组):辛伐他汀 40mg◦kg-1◦ d-1,所有药物经灌饲法喂给,M组大鼠用生理盐水模拟灌饲,8周后摘取心脏,送液氮保存。

1.3 心脏重量指数测定:洗净心脏,沿室间沟切开左室(包括室间隔),右室,吸干水分,用 FA1104电子天平测量各部分重量。然后据:左室心脏重量指数 =左室心脏重量(mg)/体重(g)、右室心脏重量指数 =右室心脏重量(mg)/体重(g)计算出左右室心脏重量指数。

1.4 心肌羟脯氨酸含量和胶原含量测定:以考马斯亮兰法测定心肌蛋白含量:称取待测左室非梗死区心肌组织,按重量体积比加生理盐水配制成 10%的组织匀浆,离心后取上清配制成 2%匀浆;取 2%组织匀浆液 0.05ml,测各管吸光度(OD值),根据公式计算蛋白含量。按操作方法将 2%组织匀浆液混匀、水浴、离心后吸取上清液测各管吸光度(OD值)。根据空白管、标准管、样品管吸光度和标准品浓度计算心肌羟脯氨酸含量、心肌胶原含量。

1.5 心肌组织内 TNF-α、IL-6和 IL-10含量的测定:8周后留取心脏标本(非梗死区心肌组织和左室冠状面梗死区中部心肌组织分别保存),-80℃保存。冰浴快速匀浆提取蛋白质,-20℃保存。以改良的 Lowry法测定蛋白。TNF-α、IL-6和IL-10表达依据试剂盒操作要求采用夹心ELISA法测定。

1.6 病理形态学分析:①石蜡包埋:在左室冠状面梗死区中部,切取厚约 2-3mm的环状心肌组织块,4%多聚甲醛(磷酸盐缓冲液配制)固定,石蜡包埋切片,切片厚度 3-4μm。②HE染色:切片二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,苏木素 -伊红染色,中性树胶封片,普通光学显微镜观察心肌组织结构。

1.7 统计学处理:数值采用均数 ±平均差(-x±s)表示。采用 SAS6.12统计软件分析,两组间行 t检验,多组间用方差分析作 q检验。p＜0.01或 p＜0.05为差异具统计学意义。

2 结 果

2.1 组织形态学改变:切片 HE染色显示:S组心肌细胞排列整齐,有少量炎性细胞浸润,无心肌细胞坏死、无间质增生(图 1A箭头所示);M组梗死区心肌细胞数量减少,结构紊乱、梗死区由胶原组织代替,有大量炎性细胞浸润,非梗死区心肌细胞代偿性肥大,间质增生、胶原堆积(图 1B箭头所示)。X组与 M组比较,心肌细胞变性坏死减轻,炎性细胞浸润减少,非梗死区心肌细胞的代偿性肥大、间质增生、胶原堆积较 M组低(图 1C箭头所示)。

2.2 辛伐他汀对心室重塑的影响:M组与 S组相比,左室重量指数(LVWI)、右室重量指 (RVWI)升高 (p＜0.01);与 M组相比,X组降低 LVWI、RVWI(p＜0.01),见表 1。

表1 辛伐他汀对左室重塑的影响(x-±s)

2.3 辛伐他汀对心肌 TNF-α、IL-6和 IL-10含量的影响:M组与 S组相比,梗死区(左室冠状面梗死区中部心肌组织)及非梗死区 TNF-α、IL-6含量均升高 (p＜0.01),IL-10含量下降,尤其以非梗死区升高更明显;与 M组相比,X组梗死区TNF-α、IL-6和 IL-10含量无明显差异 (p＞0.01),非梗死区 TNF-α、IL-6含量明显降低(p＜0.01),IL-10含量则升高(p＜0.05),见表 2。

-±s)

表2 辛伐他汀对 TNF-α、IL-6和 IL-10含量的影响(x

2.4 辛伐他汀对心肌羟脯氨酸及胶原含量的影响:心肌梗死后 8周,M组大鼠心肌胶原含量(40.58±4.31)mg/g高于对 S组(15.65±2.60)mg/g(p＜0.01)。与 M组相比,X组心肌胶原则含量降低至(24.95±5.74)mg/g(p＜0.01)。M组非梗死区心肌羟脯氨酸为(5.528±0.59)mg/g干重,高于假手术对照组(2.132±0.35)mg/g干重,X组非梗死区心肌羟脯氨酸含量为(3.40±0.78)mg/g干重,较 M组降低 22.7%。

3 讨 论

据统计,平均每 12秒就有一人死于心血管疾病,其中心肌梗死占一半以上;心肌梗死的再发率、致残率都很高,也是导致心梗心力衰竭的主要原因之一;65岁以下有急性心肌梗死病史患者近一半在8年内死亡[6]。心肌梗死后心室重构是决定心肌梗死(MI)患者心功能及预后的主要因素。心室重构包括心肌细胞形态、结构及数量分布的改变。近年来,他汀类药物具有改善心肌细胞功能、抑制炎症因子表达等多种降血脂以外的心血管保护作用[7],对缺血性心力衰竭治疗效果显著。

心肌梗死后机械牵张及神经激活致 IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TGF等细胞因子分泌增多,可以通过激活基质金属蛋白酶等许多途径导致心肌胶原沉积、心肌纤维化,是导致心肌进行性重构的重要原因。研究发现[8],IL-6在心肌慢性重构阶段表达也增加,升高程度与非梗塞区随后的胶原沉积程度一致,促进了非梗塞区心肌组织间质纤维化和胶原沉积;IL-6也可介导免疫和炎症反应,在导致斑块破裂而诱发急性心肌梗死或急性冠脉综合征中起了重要作用。

其他研究表明他汀类药物也具有直接抑制胶原合成及其 mRNA表达,减轻胶原沉积[9];可以抑制心肌基质金属蛋白酶(MMPs)激活的作用,从而发挥改善心肌间质重构的作用。氟伐他汀治疗能够显著降低非梗死区的 MMP-2、MMP-13的水平,增加非梗死区心肌的 TIMP-2的水平,从而逆转 MI后的左室重塑。他汀类药物也阻断参与心肌细胞肥大的 RAS细胞内信号传导,达到抑制心肌肥大、改善左室重塑。他汀类甚至可以提高心肌内皮型NOS(eNOS)活性、增加 NO的释放,改善内皮功能,延缓或可能阻止动脉粥样硬化进程,改善心肌缺血诱发的心脏功能障碍和心肌纤维化[10]。

本实验研究发现:心梗组大鼠心肌羟脯氨酸及胶原含量明显升高,左右室重量指数也升高,表明心梗模型成功,发生了心肌纤维化及心室重构。辛伐他汀明显减少心肌非梗死区 IL-6、TNF-α表达,部分增加 IL-10表达,减少了心肌羟脯氨酸和胶原含量,抑制心肌梗死后纤维化,同时改善急性心肌梗死后心室重塑和心脏功能,表明辛伐他汀的非降脂心脏保护机制可能与降低 IL-6、TNF-α表达,增加 IL-10表达,抑制心肌纤维化有关,发挥他汀类药物对心肌结构和功能的保护作用。我们的试验与这些研究结果一致。

总之,本实验证实辛伐他汀干预可降低 IL-6、TNF-α表达,增加 IL-10表达,这可能是辛伐他汀抑制心肌梗死后心肌胶原沉积、心肌纤维化,改善心室重塑和心脏功能的机制之一,但深入的其他机制尚待进一步探讨。

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