甲胎蛋白异质体和甲胎蛋白信使核糖核酸用于诊断肝细胞癌

韩 风 邱大鹏 陈伟瑜 张 玲 韩有志

(河南省肿瘤医院肝胆胰外科,河南郑州 450003)

肝细胞肝癌(HCC)是一种恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强的恶性肿瘤,在我国发病率有增高趋势。虽然甲胎蛋白(AFP)是诊断HCC的重要指标,但仍有30%～40%的HCC患者AFP阴性,且其对肝癌的敏感性、特异性不高,因此寻找更特异、敏感的肿瘤标志物和诊断方法就成为肝癌诊治领域的重要内容之一[1]。目前检测单个肿瘤标志物的敏感性和特异性都不能达到满意的程度,而多种标志物联合检测则可以提高检测的灵敏度和特异度。本研究探讨甲胎蛋白(AFP)异质体(AFP-L3)和AFPmRNA联合检测诊断HCC的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 112份血清标本取自本院2005年4月—2005年7月部分住院患者血清资料库,患者年龄29～77岁,平均年龄 47.16±3.5岁;男性76例,女性36例,其中肝硬化合并门脉高压(LC)11例、肝脏良性病变 19例(血管瘤12例,炎性假瘤2例,灶性结节性增生3例,血管平滑肌脂肪瘤2例),HCC 82例。所有病例均有术后病理学诊断。

1.2 试剂和仪器 USCNLIFE SCIENCE人小扁豆素结合型甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉中美科技有限公司提供);BIO-RAD M680酶标仪;引物和探针(郑州久是生物技术有限公司设计合成);Himac CR 21G低温高速离心机;HH-42三用恒温水箱;MS1 Minishkaer IKA涡旋混合器;Biometra TGRADIENT梯度PCR仪;LightCycler 1.5 ROCHE 荧光定量PCR仪;AFP酶连试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司提供]。

1.3 方法

1.3.1 患者入院后术前、术后1个月清晨分别抽取空腹静脉血5 mL,迅速分离血清(血细胞备用),-80℃贮存备测,测定前取出标本,待自然复融后检测血清中AFP,AFP-L3水平。采用人小扁豆素结合型甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)酶联免疫吸附测定试剂盒测定AFP、AFP-L3的含量,并计算AFP-L3占AFP总量的百分比,以AFP-L3(%)大于15%作为AFP-L3异常升高标准。

1.3.2 荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)用常规密度梯度离心法分离外周血有核细胞。总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,于紫外分光光度计上定量,用Primescript试剂盒反转录合成cDNA,取细胞总RNA,紫外分光光度计定量。上游引物:5′-GTAAACCCTGGTCTTGGCC-3′;下 游 引物:5′-TCAGAGAATGCAGGAGGGAC-3′,扩增最终片段长 282 bp;荧光探针:5′-TTCATATGCCAACAGGAGGCCATGC-3′。内参为 GADPH,上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物 :5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′,产物为450 bp。第1轮 PCR,反应体系为 50μL。取cDNA 5.0μL,1 0 ×PCR buffer 5.0μL,25 mmol◦L-1MgCl2 3.0 μL,10 mmol◦L-1d NTP 1.0μL,第1轮PCR上、下游外引物各7.5 pmol,Taq DNA聚合酶2.0 U,加灭菌水至50μL。反应参数:94℃5 min 预变性/94℃45 s、55℃45 s、72 ℃45 s、30 个循环72℃5 min延伸。第2轮PCR取第1轮PCR产物5μL作模板,加入7.5 pmol上下游内引物,余反应体系及反应条件同前。同时进行内参GAPDH扩增。最后绘制荧光定量PCR标准曲线,根据标准曲线计算样品和内参的Ct值,两者相比即得相对量的表达。每次RT-PCR实验均以分泌AFP的肝癌细胞系HepG2为阳性对照,阴性对照则以水取代cDNA。

1.4 统计学处理 使用SPSS 13.0统计软件包对数据进行统计学处理。各组均数之间的比较采用t检验,各组之间阳性率比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 术前两组肿瘤指标的检测结果 见表1、表2和表3。

表1 AFP检测与AFP-L3、AFPmRNA联合检测结果比较[例(%)]

表2 AFP-L3检测与AFP-L3、AFPmRNA联合检测结果比较[例(%)]

表3 AFPmRNA检测与AFP-L3、AFPmRNA联合检测结果比较[例(%)]

3 讨 论

虽然AFP作为肝细胞癌的肿瘤标志物已经沿用多年,但其敏感性和特异性均不高。1970年,Purves等[2]首先应用淀粉凝胶电泳分离出人的AFP异质体,其中AFP-L3则由肝癌细胞特异合成,与血AFP浓度间无明显关系。后来的研究[3]发现,AFP-L3对HCC的诊断、治疗效果判断及复发的预测均有意义,且较AFP更加敏感。但AFP-L3不能直接证实肝癌发生转移。1994年Matsumura等[4]首先报道采用巢式RT-PCR从有肝外转移的HCC患者外周血检测出AFPmRNA,作为肝癌细胞血液播散标志。但有一部分学者[5-6]并不支持AFPmRNA作为肝癌细胞血液播散标志物。

本研究结果显示,AFP-L3和AFPmRNA联合检测阳性率可达 87.6%,而AFP、AFP-L3、AFPm-RNA单独检测阳性率分别为69.5%、81.7%、36.6%,AFP-L3、AFPmRNA联合检测阳性率与AFP、AFPmRNA单独检测阳性率比较差异均有统计学意义。因外周血AFPmRNA水平与血AFP浓度间无明显关系,故可提高HCC诊断的灵敏度和阳性检出率,具有互补性;且可弥补总AFP浓度不能反映HCC有无转移的不足对AFP阴性肝癌的诊断具有重要的临床应用价值。

1 汤钊猷.现代肿瘤学[M].第2版.上海:上海医科大学出版社,2001:553.

2 Purves LR,van der Merwe E,Bersohn I.Variants of alpha-fetoprotein[J].Lancet,1970,2(7670):464-465.

3 Yoshida S,Kurokohchi K,A rima K,et al.Clinical significance of Lens culinaris agglutinin-reactive fraction of serum alpha-fetop rotein in patients with hepatocellular carcinoma[J].Int JOncol,2002,20(2):305-309.

4 Matsumura M,Niwa Y,Kato N,et al.Detection of a-fetop rotein mRNA.an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma,in the circulation:a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1994,20:1418-1425.

5 施裕新,林文尧,陆 键,等.外周血中AFPmRNA检测对原发性肝癌高危人群监测的意义[J].中国临床医学,2001,8(4):313-139.

6 Liu Y,Zhang BH,Qian GX,et al.Ex pression of AFPmRNA in blood of patients with recurrent hepatocellular carcinoma[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2003,2(2):274-277.