嗜铬细胞瘤基因突变检测芯片的开发和验证

武多娇 周晓鸥 高平进 朱鼎良

(1.复旦大学附属中山医院实验研究中心,上海 200032;2.上海市高血压研究所,上海 200025)

基因芯片技术是将大量探针固化于固相支持物上,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,得出样品的遗传信息。该技术具有高通量、大规模、快速、高效、高灵敏度等优点,在科研领域、生物制药和医学诊断上都具有良好的应用前景[1-2]。在疾病诊断方面,由于大部分疾病与多基因有关,利用DNA芯片可以快速寻找多个基因和位点与疾病的相关性,从而为研制相应的药物和提出新的治疗方法提供依据。

嗜铬细胞瘤是由肾上腺髓质的嗜铬细胞及交感神经节细胞形成的肿瘤,瘤组织持续或间断地释放大量儿茶酚胺引起持续性或阵发性高血压和多个器官功能及代谢紊乱。嗜铬细胞瘤患者中约10%为孟德尔遗传疾病患者,如多发性内分泌腺瘤病Ⅱ型(mutiple endocrine neoplasia type II,MEN II)[3]等。这些家族性嗜铬细胞瘤呈常染色体显性遗传[4],目前已知嗜铬细胞瘤发生与4种基因有关,它们是 RET原癌基因、VHL基因、SDHD基因和SDHB基因。目前国内外对于嗜铬细胞瘤患者的基因测试普遍采用DNA直接测序技术。然而,这些疾病的已知致病突变多达100多个,散布在4个基因,如全部测序将耗费大量人力物力。本研究设计开发一种低通量的基因芯片对嗜铬细胞瘤的基因突变进行识别和诊断,并通过与测序结果比较来评价此芯片的准确性,为临床大规模应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 芯片设计和点样 根据文献[5]选择与嗜铬细胞瘤相关的 4个基因(RET、VHL、SDHB和SDHD)共87个突变位点。检测位点全部位于基因外显子区域,涵盖与嗜铬细胞瘤相关的85%的已知变异位点。根据突变位点设计寡核苷酸探针,将探针用点样液稀释成50μmol◦L-1,用GMS 417点样仪点样至经特殊处理过的玻片上。芯片的质量控制包括阳性对照和阴性对照。点好的芯片经水合30 min、0.2%十二烷基硫酸钠及双蒸水分别洗脱10 min、干燥等过程完成芯片的制备。

1.2 样本DNA的制备 取患者外周血5 mL,用酚-氯仿方法提取DNA。嗜铬细胞瘤患者(6例)来自上海交通大学附属瑞金医院高血压病科。另有29例经基因测序已确定突变位点的DNA样本由法国巴黎蓬皮杜医院遗传中心主任Jeunemaitre教授馈赠(Department of Genetics,Höpital Européen Georges Pompidou,Paris,France)。所有病例结合临床症状、生化指标、影像学检查、外科手术及病理切片检查确诊为嗜铬细胞瘤。本研究所有受试者均签署知情同意书。

1.3 样本扩增 PCR反应标本的扩增反应采用25 μL混合体系:25 ng DNA样本,1μmol◦L-1引物,200μmol◦L-1dNTPs,1.0 mmol◦L-1Mg2+,1.5μL DMSO,0.8 g◦L-1BSA 和 2.5 U Taq聚合酶在1×Taq聚合酶缓冲体系(Takara,日本)。PCR程序:94 ℃5 min预变性、94 ℃30 S、50℃30 S、72℃45 S,40个循环;72℃5 min(MJ Research PTC-200;MJ Research,美国)。

1.4 杂交反应 杂交步骤如下:将PCR扩增液和阴性、阳性扩增液加入到同一个薄壁管中,98℃热变性5 min,取出后迅速放入冰盒,在-20℃环境中放置5 min。然后取出基因芯片,做好样品编号,在杂交舱中加入预杂交液后在42℃环境中静置5 min,吸除该缓冲液;吸取杂交缓冲液与已变性的PCR扩增产物混合物混匀,将液体全部加入到杂交舱中,42℃杂交30 min。吸除杂交舱中溶液后清洗2次。

1.5 显色反应 检测探针采用生物素标记,碱性磷酸酶(AP)催化的NBT/BCIP显色反应。在杂交舱中加入抗体溶液,室温放置20 min;吸除杂交舱中溶液,清洗2次;向杂交舱中加入显色液溶液,42℃避光放置40 min。吸除杂交舱中溶液,小心揭除杂交舱,用蒸馏水冲洗后,置42℃烘干;将显色载玻片面朝下置于BaiO生物芯片识读仪片槽上检测。

1.6 检测分析 图像经Array Doctor软件分析可自动输出检测结果。各个信号值均经过背景信号值的校正。芯片中1个检测位点由相邻的3个杂交点组成,计算3个杂交点的均值为该检测位点的信号值,然后将野生型与突变型位点的信号值进行比较以判断是否存在位点突变。

2 结 果

2.1 芯片杂交质量控制 芯片的扫描结果显示,阳性参照有明显的杂交信号,信号强度基本一致,说明芯片杂交、扫描等步骤正常,该阳性参照的杂交信号可作为内对照进行校正(即进行标准化处理)。阴性参照无信号检出,说明无非特异性杂交。

2.2 芯片杂交和基因测序结果比较 用于芯片检测的35例DNA样本均来自散发确诊的嗜铬细胞瘤患者。以基因测序结果为标准,其中29例DNA样本经基因测序已明确存在1个突变位点,另外6例DNA样本经测序未发现突变。芯片检测结果显示91%的样本芯片杂交与基因测序结果一致。尤其是这两种方法对SDHD和RET基因突变位点的检测符合率为100%(表1,图1)。另外在6例测序证实无突变的样本中,芯片检测结果同样为阴性。因此,芯片杂交和基因测序的结果十分一致。但是有3例样本经芯片检测与基因测序比较仍存在差异(表1)。其中2例测序得到的SDHB基因突变位点(外显子 6,密码子 198,核酸 591del C)和(外显子7,密码子23,核酸CGC→TGC)芯片未能检出;另外有1例VHL基因突变位点(外显子3,密码子167,核酸499 CGG→TGG),芯片杂交显示较弱信号,强度仅为野生型信号值的30%,无法将其判断为特异性杂交,提示杂交条件仍需改进。

表1 基因芯片和基因测序的结果比较

图1 基因芯片杂交图图1为芯片杂交图,左侧为对照,右侧为阳性标本杂交结果。右侧中左边红框内是RET基因的野生型(外显子11,密码子634,核酸TGC),右边红框内为该位点突变型(外显子 11,密码子 634,核酸TGC→GGC突变)。

3 讨 论

一些方法,例如传统的基因序列分析、单链构象多态性(SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性毛细血管电泳(DCE)和变性高效液相层析(d HPLC)均可用于检测基因突变,但这些技术都各有相应的优缺点,例如费用高、耗时及检测量和可检测突变类型的有限制等[6-7]。相比而言,基因芯片通过杂交反应检测嗜铬细胞瘤相关基因突变较快速、简便、经济实用,适用于临床大量样本的基因筛查和测试。

本实验开发的基因芯片用于检测嗜铬细胞瘤相关的4个基因(RET、VHL、SDHB和 SDHD)共计87个突变位点,这些位点全部位于外显子区域,涵盖与嗜铬细胞瘤相关的85%的变异位点。本实验共验证4个基因29个突变位点,检测结果证实芯片杂交和基因测序的结果一致,尤其是在对于SDHD和RET基因突变位点的检测中2种方法符合率为100%。在6例无突变的样本中,芯片与测序结果一致。

对本芯片研究我们获得以下体会:在引物探针设计方面,MgCl2浓度的改变对聚合酶链反应(PCR)效果的影响较大,扩增片断较短杂交效果好,以后的实验应把扩增片断控制在200 bp以内,位点离生物素标记的引物3'端不宜太近,否则由于扩增片断,产生空间位阻而影响杂交。并且部分探针间隔臂的长度由16变为30,比增加探针长度效果好,特别是当扩增产物在检测位点附近序列的二级结构比较复杂时,用这种方法比较好。

本实验的基因芯片虽然显示出良好的识别突变位点的效能,但在个别样本中也显示其不足之处。由于未收集到所有基因突变类型样本,用合成的寡核苷酸验证样本的突变探针,然而合成的寡核甘酸探针与真实DNA扩增片断在长度和结构上存在一定的差别,它并不能完全模拟真实DNA扩增片断与固定在芯片上的特性探针的杂交反应,所以不能保证在以后的应用中能准确检测出预实验中没有的基因型。因此本芯片投入实际应用前,尚需要更多样本的验证。

DNA芯片的高密度信息量和平行处理的优点不仅使多基因分析成为可能,而且保证了诊断的高效、廉价、快速和简便。本研究开发的基因突变检测芯片经过现有标本的检验,具有识别嗜铬细胞瘤相关基因突变的良好功能,在嗜铬细胞瘤的基因诊断中可望具有良好的应用前景。

1 Cooke EJ,Savage RS,Wild DL.Computational approaches to the integration of gene expression,Ch IP-chip and sequence data in the inference of gene regulatory networks[J].Semin Cell Dev Biol,2009,20(7):863-868.

2 Ding C,Jin S.High-throughput methods for SNP genotyping[J].Methods Mol Biol,2009,578:245-254.

3 Pomares FJ,Canas R,Rodriguez JM,et al.Differences between sporadic and multiple endocrine neoplasia type 2A phaeochromocy toma[J].Clin Endocrinol(Oxf.),1998,48:195-200.

4 Inabnet WB,Caragliano P,Pertsemlidis D.Pheochromocytoma:inherited associations,bilaterality,and cortex preservation[J].Surgery,2000,128:1007-1011.

5 Neumann HP,Reinck e M,Eng C.Case 13-2001:genetic testing in pheochromocytoma[J].N Engl J Med,2001,345:547-548.

6 Korthals M,Ege MJ,Tebbe CC,et al.Application of PCR-SSCP for molecular epidemiological studies on the exposure of farm children to bacteria in environmental dust[J].J Microbiol Methods,2008,73(1):49-56.

7 Lilleberg SL.In-depth mutation and SNP discovery using DHPLC gene scanning[J].Curr Opin Drug Discov Devel,2003,6(2):237-252.