宫颈癌与hpv关系的研究进展

梁东霞综述 张彦娜审校

宫颈癌是1种常见的女性恶性肿瘤。目前我国的宫颈癌发病呈总体下降但年轻患者增加的趋势。分子流行病学研究已经证实：人乳头瘤病毒(HPV)的感染与宫颈癌有着十分密切的关系。宫颈癌的筛查可以降低宫颈癌发生的危险，却不能阻止HPV的感染。目前对HPV的感染尚无确切治疗方法，但是已有研究采用HPV的疫苗来预防和治疗该病毒的感染，以此来预防宫颈癌的发生。有大规模研究证实，应用HPV疫苗的获益大于风险[1，2]。因此，研究HPV和宫颈癌的关系对于宫颈癌的预防及治疗都有重要意义。

1 HPV是宫颈癌的病因之一

1.1 HPV及其型别

HPV是种嗜上皮性DNA病毒，其DNA包括早期基因区(E)，晚期基因区(L)和长控制区(LCR)3个部分。早期基因区可以编码E1，E2，E4，E5，E6，E7等早期蛋白，其功能与病毒的复制、转录、翻译调控和细胞转化有关，其中E6，E7是主要的致癌基因。晚期基因区可以编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。长控制区含有HPV基因组DNA的复制起始点和基因表达所必须的控制元件，调控病毒基因的转录复制。

目前已知的HPV型别有100多种，其中约35种涉及生殖道感染，约20种与肿瘤相关。根据HPV型别与子宫颈癌发生危险性高低分为低危型HPV和高危型HPV。低危型HPV包括HPV1、6，11、42、43等，常引起生殖道疣等良性病变。高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等，与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变(CIN)相关[3]。HPV感染的亚型分布具有一定的地域性差异[4]，在亚洲国家中，除了16和18型之外，58和52型引起的宫颈癌所占比例较西方国家及非洲国家多。

1.2 宫颈癌发展与HPV的关系

在细胞学检查正常的妇女中HPV的感染率为10.2%～40.0%，低级别鳞状上皮内病变(low grade squamous intraepithelial lesion，LGSIL)中HPV感染率为64.4%～90.9%，高级别鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion，HGSIL)中HPV感染率为73.3%～100%，宫颈癌患者中，HPV感染率为88.4%～99.7%[5]。我国的类似研究也得出了相同的结论，从宫颈炎到宫颈癌的患者中，HPV的感染率随着病变级别的升高逐渐上升，HPV多型感染率随宫颈病变程度加重而升高，宫颈癌组的多型感染率最高[6～8]。

一项研究评估了1952～1992年之间的宫颈癌自然发展史，有60%病例CIN I消退，30%持续，10%进展为CINⅢ，其中1%发展为浸润性癌。最近的资料评估，47%LSIL消退为正常，21%发展为高度鳞状上皮内损害(HSIL)，0.15%将发展为癌[3]。HPV感染持续存在1～2年可引起轻微病变；LGSIL在2～4年中有15%～20%转化为HGSIL；HGSIL发展到癌前病变需9～10年；癌前病变发展到浸润癌需4～5年。即从HPV感染开始至发展为宫颈癌的时间间隔为15年[9]。多项研究结果均表明，高危型HPV的持续感染是宫颈癌进展的重要原因，而病毒载量是影响宫颈病变及发展的重要因素[10]。

对宫颈癌组织标本的研究发现，99%以上的宫颈癌有HPV感染，其中HPV16和18型的感染率最高，约70%。HPV16型感染多见于宫颈鳞癌，而18型多见于宫颈腺癌[11]。

但是，HPV感染率高低是否是宫颈癌病变进展的确切指标，哪些亚型的HPV导致宫颈癌进展的可能更大，宫颈癌的转归、宫颈癌的病理分型与HPV的亚型是否有对应关系，HPV的各亚型有怎样的协同作用，哪些患者的病变更容易进展为癌，目前尚无定论。

2 HPV的致病机制

2.1 与E6，E7相关的致病机制

HPV有严格的嗜组织性，主要侵犯皮肤及黏膜鳞状上皮。HPV DNA在宿主细胞中有2种存在方式，即整合状态和游离状态(染色体外的附加体形式)。在癌前期组织中，病毒常位于染色体之外，而在癌症进展期，病毒DNA以单拷贝或多拷贝串联方式整合于宿主细胞DNA中，其结合位点多位于E2附近，结果导致HPV E2基因对E6、E7基因启动的负相调节作用的缺失，使E6、E7基因表达异常而导致细胞生长失控。

在病毒复制过程中起关键作用的是病毒的E6和E7蛋白，实验已经证明这两种蛋白可以与许多蛋白分子相互作用，并引起细胞的无限增殖和恶性转化[11]。E6、E7蛋白通过与细胞周期调节因子p53和Rb蛋白结合发挥其致癌作用。

p53是重要的肿瘤抑制蛋白，在细胞生长周期中起负调控作用。当DNA损伤时，p53基因表达显著上调，通过促进其下游靶基因p21基因的转录，增加p21的合成，诱导细胞停滞在G 期来发挥其抑制细胞增殖的作用。E6蛋白能与细胞内E6相关蛋白(E6-AP)形成复合物，特异性地结合p53，并通过依赖蛋白酶系统将其水解，使其对细胞生长负调节功能丧失，从而引起细胞无限增生并向恶性转化[11，12]。作为1种多功能蛋白，它还可通过激活端粒酶使正常细胞永生化。研究发现E6还与其它蛋白(如靶蛋白1，干扰素调控因子3，p21等)有相互作用，同时还与凋亡有关。

E7蛋白是HPV的主要转化蛋白，与控制细胞周期有关的肿瘤抑制蛋白视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)亲和力极高，E7与Rb结合使Rb-E2F复合物解离，E2F被游离，从而发挥其转录因子的作用，导致细胞周期失控而发生永生化[11]。另外，E7还可以抑制p21CIP1和p27KIP1，促进cyclin A，E的表达，使得G1/S节点失控，导致突变累积。

2.2 其他相关的研究进展

RASSF1A(Ras association domain family lA)基因是2000年发现并克隆出来的新型候选抑癌基因，位于人染色体3p21.3。Cohen等[13]用实时甲基化特异聚合酶链反应(PCR)方法检测20例宫颈腺癌，其RASSF1A启动子甲基化率为45%，3l例鳞癌中未检测出启动子甲基化，认为RASSFlA的失活可能在宫颈腺癌的发展中起重要作用。Lee等[14]报道的258例子宫颈癌中，RASSF1A甲基化率在鳞癌中为7.1% ，腺癌中为92.9% ，并且RASSF1A的甲基化与HPV18显著相关(P<0.001)。这些结果说明，RASSF1A可能是位于3p21区的宫颈癌相关肿瘤抑制基因，且与高危型HPV 存在一定的相关性，但RASSF1A失活与高危型HPV感染的关系和确切机制还有待进一步研究。

FHIT 是近年新发现的抑癌基因。它位于染色体3p14.2 区域；覆盖染色体3p上的脆弱位点FRA3Bt[3]。断裂点及HPV16 整合点；有研究证实FHIT也许在宫颈的高度鳞状上皮内瘤变的恶性潜力预测中有价值。在宫颈上皮内瘤变宫颈癌Ⅲ度(CINⅢ)病变和微浸润性宫颈癌(MICA)中FHIT蛋白表达的减少和丢失分别为50%和78% ，而它们中的70%为LOH。FHIT基因的甲基化在宫颈癌的发生中也起到一定的作用，并有学者认为FHIT表达状态与宫颈癌的侵袭度密切关联，由此认为它可以用来判断患者的预后情况[15]。

另外有研究发现，宫颈癌中Survivin mRNA的表达与HPV16/18感染呈正相关，由此推测前者可能在调节细胞凋亡过程中参与HPV介导的宫颈癌变过程[16]。

还有许多其他HPV相关的基因或者蛋白正在被研究，虽然我们尚不能确定目前所感兴趣的这些基因或其他的研究热点是否与HPV有很强的相关性，但是我们相信，对宫颈癌和HPV关系的研究将使得我们更加清楚这一疾病的进展，对我们最终攻克这一疾病有很大帮助。

3 HPV与宫颈癌预后的关系

对于宫颈癌患者，对前哨淋巴结进行HPV-DNA的检测，可以发现有淋巴结转移和复发风险的患者[17]。淋巴结转移与否是很强的独立预后因素，早期诊断淋巴结微转移有利于患者的个体化治疗，减少复发和转移。淋巴结中检测到HPV-DNA可能预示着转移的存在，有实验表明，宫颈癌淋巴结转移者HPV-DNA的阳性表达率显著高于无淋巴结转移者，因此建议术后切除的淋巴结除了进行病理检查以外，辅以HPV-DNA的检测可能更安全[18]。检测宫颈癌旁组织，包括盆腔淋巴结组织中的HPV-DNA拷贝数及进行亚型鉴定可能有助于发现癌旁微小转移并指导术后治疗，值得关注[19]。也有研究发现，VEGF过度表达者更容易发生盆腔淋巴结转移，因此认为联合检测高危型HPV和VEGF，有助于探讨CIN及宫颈癌的发病机制及提高诊断率[16，20]。有研究显示，HPV-16 DNA的整合状况可能是有价值的宫颈癌预后指标[21]，但其在临床的应用价值尚需随访研究证实。目前，我们尚未得到HPV相关的能准确预示宫颈癌复发的指标，这需要更多更深入的研究。

4 宫颈癌筛查

HPV感染是CIN、宫颈癌的明确病因，99%以上的宫颈癌有HPV感染。HPV检测已成为宫颈癌的常用筛检方法，通过HPV的筛查，可以发现宫颈癌早期病变的患者，或者具有高危因素的人群，有利于宫颈癌的早期发现和早期治疗，对于宫颈癌的预防及治疗以及降低宫颈癌的发病率和死亡率有着非常重要的意义。2003年卫生部制定的《宫颈癌筛查及早诊早治指南》建议有3年以上性行为或2l岁以上有性行为的妇女应每年进行1次细胞学检查，连续2次细胞学正常可改至3年后复查；连续2次HPV检测和细胞学正常可延至5～8年后复查。

4.1 现有的HPV检测方法

传统的细胞学检测方法有巴氏涂片法，薄层液基制片技术、计算机辅助检测技术等(主要有：TCT法、PAPNET法)。目前所广泛应用的其他方法还有阴道镜检查，组织病理学检查，血清学方法等[22]，但这些方法都有一定的缺点，因而促使我们不断的开发新的检测方法，以提高准确率。

4.2 HPV-DNA检测方法

目前所使用的方法有以下几种：核酸杂交技术(如斑点杂交法，荧光原为杂交法，southern杂交法等)，聚合酶链反应技术(如通用引物PCR，荧光定量PCR，实时PCR，间接原位PCR等此外，尚有PCR—ELISA检测，PCR结合双向点杂交技术检测，竞争性定量PCR ，单管巢式PCR和直接原位PCR)，基因芯片技术，杂交捕获技术(其中第二代杂交捕获试验灵敏度和特异性均较好，更适合大范围人群的筛查，目前已得到全世界的广泛认可，广泛应用于临床)，SP法染色检测HPV早期蛋白E6[22，23]等。这些技术在准确率和特异性方面已经取得很大进步，但是仍然存在一定的缺陷，如，操作步骤繁杂，标本的要求高，容易污染，部分方法不适宜大规模应用于临床，存在一定的假阳性，在准确率和特异性方面也不够理想，价格较为昂贵等，这就要求我们必须不断发展新的检测方法，并努力改进现有的检测方法，使得其检测效能进一步提高。

4.3 多种检测方法的联合应用

鉴于单一方法检测的缺点，临床上多采用联合多种检测方法以提高准确性，有研究报道，TCT法和HC-2法同时应用于HPV-DNA的检测，其阳性预测值可达99.9%[22]，美国和欧洲已将这两种方法作为宫颈癌的早期筛查方法。

将HPV-DNA检测和细胞学检查联合应用进行宫颈癌及CIN的筛查，其效率大为提高[24]，有研究结果显示，联合筛查检测效率几乎可达100%。目前也有相当多的研究比较各种不同方法联合检测的优劣，但是具体使用哪些检测方法的联合，还要考虑到经济成本，实验室条件，检测人员培训情况，以及患者的选择等多个方面的因素，应根据各地的具体情况决定。

5 宫颈癌的预防和HPV疫苗

5.1 HPV疫苗的原理

主要存在3种病毒蛋白可以诱导机体产生免疫应答，包括：病毒癌基因E6，E7；其他早期蛋白，如E1，E2，E4，E5；病毒衣壳蛋白L1，L2。针对这3种蛋白可以制备多种病毒疫苗[17，19]。

目前的HPV疫苗可以分为预防性疫苗和治疗性疫苗，其中，预防性疫苗多将衣壳蛋白L1和L2组成的VLPs作为靶抗原，诱导机体产生特异性中和抗体，从而达到预防效果[25]。预防性疫苗不含有病毒DNA和癌蛋白，因而具有较高的免疫原性和安全性。治疗性疫苗多将E6和E7蛋白作为靶抗原，理想的治疗性疫苗可以使机体产生HPV特异性细胞毒性T细胞(CTL)。目前研究的治疗性疫苗主要有重组牛痘病毒疫苗，a病毒载体疫苗，腺病毒载体疫苗，细菌载体疫苗，基因疫苗，肽段疫苗，p16INK4a疫苗，融合蛋白疫，细胞疫苗等。

HPV嵌合疫苗也是目前的1个研究热点，包括以下3种类型：同型HPV的不同期蛋白的嵌合，如将HPV16早期蛋白和衣壳蛋白嵌合；不同型别的HPV病毒蛋白的嵌合；HPV和其他种类的微生物的嵌合，如将HPV和HIV的嵌合[25]。

根据抗原肽种类的多少，还可以将HPV疫苗分为单价疫苗和多价疫苗。单价疫苗的靶抗原是单一的抗原肽，而多价疫苗可针对多种HPV型别的多个抗原肽或者蛋白片段。

5.2 研究现状

目前已经上市的预防性疫苗有：由GSK公司开发的HPV疫苗，为包含HPV16和HPV18的VLPs双价疫苗，它是使用杆状病毒感染的昆虫表达体系表达重组的HPV16 L1 VLPs，并使用其专利佐剂AS04；另1种由Merck公司开发的HPV疫苗为四价疫苗，包含HPV16/18/11/6的VLPs，其用单一铝盐为佐剂。使用佐剂可以减少注射剂量和在冷藏时使疫苗稳定。临床试验结果证明上述几种疫苗均具有良好的耐受性，且没有严重的不良反应，抗体效价比自然感染HPV的患者高50倍[26，27]。

以E2作为靶抗原的重组MVA-E2 vV疫苗(属于重组牛痘疫苗)可以有效清除病变，减少HPV负荷[26]。改造的E7腺病毒疫苗刺激的树突状细胞(DC)可诱导CD8 T细胞依赖的E7特异性抗肿瘤反应。由HLA-A2呈递，有2个HPV16 E7肽段构成的疫苗与福氏佐剂免疫复发性或癌细胞残存的宫颈癌患者，可诱导患者的肿瘤免疫。Nventa公司研发的HspE7属1种融合蛋白疫苗，HspE7是HPV16型E7蛋白与牛分枝杆菌Hsp 65融合而成。临床研究显示，HspE7对由HPV引起的相关疾病有较好的治疗作用。利用重组的全长E7刺激HPV16或HPV18阳性的宫颈癌患者自体DC，可以诱导特异性CTL杀伤自体肿瘤细胞。受E7刺激的DC不仅能诱导特异性CD4 T细胞增殖反应，而且能增强CTL杀伤肿瘤细胞的能力[26]。

有研究提示，内源性周期依赖性蛋白激酶抑制因子p16 INK4a可能诱导免疫应答，不仅可以抗病毒癌基因E6和E7，还可以抗来自p16 INK4a蛋白的抗原肽。因此，p16 INK4a也许有望成为HPV相关癌症治疗性疫苗的1个候选因子。HPV16 E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达，部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一[28]。

目前还有很多种类的疫苗正在研究过程中，在动物实验和体外试验中取得了一些成果，同时也有很多新的研究不断提出新的方向和策略。但是要达到我们找到安全可靠的宫颈癌疫苗的预期目标，我们还需要更多更深入的研究。

5.3 存在的问题及展望

目前HPV疫苗研究中所遇到的问题大概可以分为以下几方面:部分疫苗的免疫原性较弱，不足以引起机体的抗肿瘤反应；细胞疫苗的制备过程复杂，成本较高，难以规模化生产和使用；基因疫苗的整合具有潜在危险，安全性有待观察；各种载体疫苗都有可能诱导机体产生针对载体的抗体，导致该疫苗的应用受限；疫苗的免疫效应期限较短，且应用于临床的时间不长，不利于一些小概率的不良反应的观察；关于疫苗的安全性问题也是我们关注的焦点，目前常见的副反应是局部的红肿、疼痛，头痛和低烧，尚无更严重副反应的相关报道[29]；对于疫苗的接种对象，接种时间间隔以及最适剂量，免疫途径等问题还需要更多的临床研究，接种后如何进行后续的检测也是需要研究的问题之一；HPV疫苗对于男性的保护作用还有待研究和观察；HPV的型别较多，单独筛选某些型别的HPV疫苗比较困难；虽然目前有试验证明，HPV疫苗在孕妇和哺乳期妇女的应用未对胎儿和婴幼儿造成影响，但是我们仍需更多的研究和观察来证实这一结论。

基于目前研究资料的总结，我们有理由相信，HPV疫苗的应用对妇女的健康是安全且有效的[1，3，30]。针对目前研究中存在的问题，我们还有大量的研究工作要做，但是随着HPV研究的进一步深入和科技发展的进步，HPV疫苗将更加安全可靠，并将造福于更多的人。

综上所述，HPV和宫颈癌的发生，发展，治疗和预防都有着密不可分的关系，对于HPV的深入研究将有利于我们加深对于宫颈癌的认识，最终使得宫颈癌的治疗取得更大进展，宫颈癌的筛查可以早期发现宫颈癌患者，而HPV疫苗的研究将使得宫颈癌的预防成为可能。

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