物理因素在产表面活性剂菌种改良中的应用*

张祥胜，向廷生

(1.山东大学 微生物技术国家重点实验室,山东 济南 250100；2.长江大学 地球化学系,湖北 荆州 434023)

1 生物表面活性剂的相关概念

目前大多数市售的表面活性剂主要是来自石油基的化学产品，其生产过程需要消耗大量的石油产品，易污染环境，而且受到原材料、价格和产品性能等因素的影响，在生产和使用过程中常常会带来严重的环境污染问题以及对人体的毒害问题。而生物表面活性剂则不存在这样的问题，因而日益受到国内外研究者的关注，成为近年来的研究热点。

生物表面活性剂是由微生物在一定条件下产生的同时具有亲水性和疏水性两种结构的代谢产物，按分子量大小，可分为低分子和高分子两类生物表面活性剂。低分子生物表面活性剂能有效降低表面或界面张力，其中以枯草芽孢杆菌的surfactin最为有名[1]；高分子生物表面活性剂主要功能不在于降低界面张力，而是分布在油滴的表面，对油/水界面表现出很强的亲和力，从而有效地阻止它们的聚并，可使乳状液得以稳定，因此又称生物乳化剂。研究最早也最为详细的高分子生物表面活性剂是来自醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)RAG-1的Emulsan[2,3]。本文中所指表面活性剂主要指前一种。

同一般化学合成的表面活性剂一样，生物表面活性剂具有以下特点：具有显著降低表面张力、较低的临界胶束浓度，对温度、pH和盐度不敏感，还具有专一性强，低毒性、可生物降解、环境友好、可利用廉价农副产品生物发酵生产等优点，某些生物表面活性剂还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用及生理活性。生物表面活性剂已在石油[4,5]、食品、化妆品及药学等领域获得广泛的应用[6]。另外，在疏水性污染物(石油、有机氯农药、多氯联苯和多环芳烃等)污染土壤的生物修复中也发挥了巨大作用[7,8]。

2 物理诱变因子种类及其在表面活性剂产生菌改良中的应用情况

提高代谢物的产量一般通过两种方法，即优化菌株的发酵培养基成分和通过各种技术手段来提高菌株的产量与活性。使用诱变或重组高产菌来提高产量还处于研究的初级阶段，其中诱变由于使用经济方便，因而成为获得生物表面活性剂高产菌的一种重要方法[9]，尤其是物理因子法以其安全、设备简单、操作方便、价格低廉、诱变率高等优点而受到人们的特别关注[10]。

微生物诱变育种常用的物理因素主要是各类辐射，其实质是造成不致死但修复错误的损伤，引起辐照细胞内的遗传物质(主要是DNA)发生点突变或染色体畸变，从而有可能提高产量[11]，具体过程主要包括物理阶段、物理化学阶段、化学阶段以及生物学效应4个阶段。

物理因素包括紫外线(非电离辐射)和电离辐射。而低能离子束作为一种较新颖的诱变源，虽然也是电离辐射，但由于其独特性，单独加以介绍。在国外，各种辐射主要用于放射生物学或癌症放疗的研究，故生物表面活性剂产生菌的物理诱变的资料较少。本文主要介绍国内的研究进展情况。

2.1 紫外线

紫外线照射波长范围为10-380nm，其引起生物体的主要损伤是相邻碱基形成二聚体，阻碍碱基的正常配对而导致碱基置换突变[12]，用紫外线辐射产表活微生物以获得高产菌株的文献报道较多。

宋绍富等对高效驱油菌I进行紫外诱变，培育出代谢性能较好的菌株，发酵液的界面张力可由6.49 mN/m降低到5.86 mN/m，降低了9.7 %[13]。Mulligan等对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株ATCC 21332进行紫外诱变，将原菌株培养到对数期并转移大约300个细菌到营养琼脂平板上，然后用短波紫外灯辐射大约35 s，得到产量提高3-4倍多的突变株[14]。

2.2 电离辐射诱变

电离辐射主要用的是γ射线和X射线。Raza[14]对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida 33)进行γ射线诱变，得到突变株300-B，使用不同的疏水性碳源(烃类、植物油提炼厂废物等)对该突变株进行发酵培养产鼠李糖脂，得到最大生物量3.5 g·L-1、最大鼠李糖脂产量为4.1 g·L-1。Iqbal 等对铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa) S8进行γ射线诱变，得到以烃为碳源的高产表活突变菌EBN-8。突变体用原油烃为碳源的无机盐培养基时表现出比出发菌株高3-4倍的烃乳化和转化能力，在以十七烷为碳源时也表现出较高的表活产率(以乳化指数和无细胞发酵液的表面张力为指数)，同时生长速率增加了2-3倍[15]。

2.3 低能离子束诱变

在产表面活性剂菌种改良方面，中国科学院离子束生物工程学重点实验室走在前列。刘清梅用低能离子束诱变改良产脂肽枯草芽孢杆菌，应用参数为能量20 keV、剂量2.6×1015N+/cm2，经过多轮诱变得到一株表面活性大为提高的突变菌株E-8。该菌株Landy培养基的去细胞发酵液稀释50倍和100倍后，其表面张力值为27.1 mN/m和28.5 mN/m，分别比出发菌同等条件下表面活性提高4.6倍和16.4倍。而该菌株的生长特性和表面活性物质的产生特性与出发菌株相比，变化不明显[16]。在此基础上，对培养基进行了优化，并成功转化为产品[6]，商品名为莎梵婷，获得了可观的经济和社会效益。同时用低能离子辐照胜利油田油层中分离得到的一株细菌Sp-5-3，最终得到一株产物乳化性能大为提高的突变菌株S-34[17]。但除此之外，几乎没有报道，最新相关综述文章认为离子束诱变技术在获得生物表面活性剂高产菌上还没有应用，并且还认为离子束诱变获得的突变菌株回复突变率较高[9]。但依笔者的体会和其他研究者的文献报道，显然这是不科学的观点。这也说明，由于离子束生物工程学装置造价较高(目前市场价约100万元/台)，应用相对较少[18]，国内生物表面活性剂研究者多数还没有认识到离子束诱变技术的作用。离子束诱变技术仍是获得生物表面活性剂高产菌有潜力的手段之一。

2.4 其他物理诱变技术

霍丹群等用自主研制的基于梳状交叉微电极阵列结构的细胞电操作系统，开展产表面活性剂BS-37菌株选育研究，获得一株高产菌，其表面张力从51.47 mN/m降低至37.59 mN/m，乳化力从62 %升高至85 %[19]。另外，以下几种新型的诱变技术值得注意，但目前应用于产表活微生物的研究未见报道。

一是空间诱变育种。又称航天育种或太空育种，是指利用返回式卫星、飞船或高空气球将生物材料搭载到太空，利用太空特殊的环境(空间宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等因素)对生物材料进行诱变，再返回地面选育新种质、新材料，培育新品种的生物育种新技术。这些空间条件都有可能引起微生物发生遗传性变异。空间突变的最大特点是突变频率高、突变谱广、变异幅度大、变异性状稳定快从而使育种周期缩短、生物安全性提高[20,21]。

二是微波辐射。属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在300 MHz-300 GHz，对生物体具有热效应和非热效应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应。 目前主要应用于曲霉、沙门氏菌、酵母[22]、孢霉属真菌[23]等。如，在白僵真菌的诱变效果上，微波略优于紫外线，而且操作更简单[24]。

三是激光。为一种量子流。激光作用于生物组织后产生热、压力、光化和电磁场等的现象，起主要作用的是光效应和电磁场效应，引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变[25]。激光诱变技术具有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等优点，在微生物育种实践中取得了一定成果。激光可应用于微生物诱变育种和介导转基因，具有较大的潜力[26]。目前湖南师范大学激光辐射生物实验室的研究较为领先。

在利用单一物理因子作用于微生物的同时，开始尝试用多种物理因子组合作用微生物。但在产表活菌的改良上用的不多。常见的组合是属非电离辐射的紫外与属电离辐射的离子束、γ射线的组合。

2.5 物理诱变因子和其他诱变技术手段的复合

刘七[27]等以自行分离的兼性厌氧菌I为出发菌株，经过紫外和甲基磺酸乙酷复合诱变，得到1株性能优良的变异新菌株，可将界面张力从6.49 mN/m降低到4.36 mN/m，降低了32.8 %。沈薇等以产糖脂类生物表面活性剂的铜绿假单胞菌BS-03为出发菌株，对其进行UV和UV+LiCl的诱变，筛选得到1株产量提高了1.658倍(由4.1 g·L-1提高到6.89 g·L-1)的菌株LY4[28]。

3 物理诱变产表活微生物要注意的几个问题

物理因子的生物效应研究是生命科学的重要内容，也是物理学与生物学自身发展、相互渗透、分支交融的必然结果。物理因子诱变微生物的研究与应用具有极其重要的实践意义[10]。下面就以下几个问题展开讨论。

3.1 综合运用多种技术

传统的诱变育种技术中存在的突变不定向、效率低、性质不稳定、有益突变率低、易发生回复突变等缺点[9]，尤其是即使是一些新型的物理诱变技术，如离子束、低温等离子体、激光、微波和空间诱变技术等，也是不定向的。因此，综合运用物理诱变技术(主要是非电离辐射诱变与电离辐射诱变相结合)或将物理诱变技术与化学诱变技术、基因工程技术等相结合，努力提高诱变效率、获得稳定的突变体等，是大有可为的。尤其是根据菌种改良技术的进步和实际需要，发展定向物理诱变技术，是目前的努力方向之一。

自身产物的诱变技术也有报道。例如秦新政等对鼠李糖脂生产菌种假单胞菌进行高浓度的鼠李糖脂处理，获得了产量提高50 %以上的突变株[29]。Carrera Paolo等人专利报道培育成一株耐反馈抑制的枯草芽孢杆菌菌株ATCC55033，在反应器中加入其自身合成的脂肽时，对自身生长影响有限，对脂肽的合成也无抑制作用，由此脂肽产量提高了1倍[30]。今后在进行物理诱变时，也可以借鉴这一研究思路，即在高浓度的产物添加到筛选平板和摇瓶中，期望得到抗反馈抑制或阻遏的突变株。

3.2 确定合适的评价和筛选方法

测定生物表面活性剂产生的方法有：液滴坍塌法[31,32]、排油圈法和血平板裂解法[33]。血平板法的缺点是，如果血平板制作不好则不易发现溶血圈，直接影响到实验结果的观察，也不能用于需要烃类物质才产生表面活性剂的微生物的筛选，而且溶血活性也可能与微生物存在溶血酶有关，而不是因为微生物产生了生物表面活性剂。96孔板液滴坍塌法，被国外研究者认为是一种高通量分析技术[31]，且精度较高，但操作繁琐，且不适宜检测低剂量表面活性[32,34]。排油圈法是较为常用的一种方法。表面活性剂浓度与排油圈直径和培养液表面张力之间都呈线性关系，通过它们之间的线性图，根据其中的一个参数就能计算出另外两个参数[35]。如果能用血平板筛选的，尽量用血平板筛选，毕竟平板筛选还是便捷高效的方法，大分子乳化剂往往不能产生溶血圈，或是以烃为碳源的产表活菌也不能用血平板筛选，可以考虑用油平板[36]或蓝色凝胶平板筛选[37]，也可以改进配方，比如用发酵培养基做基本培养基，再加CTAB和亚甲基蓝。如不能用平板进行筛选，则可以采用发酵后测定发酵液无细胞上清的排油圈的方法进行筛选，取排油圈较大的测表面张力，结合测定发酵液的乳化能力，并最终以粗提物产量为复筛的指标。

在高产育种实践中，为了提高筛选效果，在平板初筛时，可采用小琼脂块大通量筛选法。小琼脂块大通量筛选法是日本学者八木建立，后用于春雷霉素选育，筛选效果良好[38]。但这种方法要求菌落及产物扩散性好，故更适于放线菌和丝状真菌的抗生素产量性状的筛选，实际上目前大多数文献处理材料都是这两类微生物[39,40]。笔者曾尝试采用该法筛选产糖脂的假单胞菌高产菌株，实际操作中遇到一些问题，如琼脂块易干燥，采取保湿措施则易污染，细菌菌落扩散很慢，达不到琼脂块的边缘，琼脂块与筛选平板结合的紧密程度影响糖脂在筛选平板中的扩散，即使是同一个菌株，透明圈直径差异也较大等，但相信采取适当的措施，克服困难，即可使这一高通量筛选方法在产表活高产菌筛选中获得应用。

3.3 既要重视产量，也要重视品质。

目前中国在开发和改良产表活微生物方面仍与国外有较大差距，如国外已经将糖脂或脂肽产量提高到50 g·L-1的水平[30]，在产量方面仍需努力，但品质方面仍要重视。研究和应用最广泛的是糖脂，其中又以铜绿假单胞菌生产鼠李糖脂为主[29]，脂肽类表面活性剂研究得不太多。同是10 g·L-1的产量，糖脂和脂肽的功性显然是不同的，或是诱变后的产量虽然有了大幅度提高，但如果品质下降或性能下降，显然也没有达到预期目的。当然，也有研究者已经认识到这方面的问题。Noha H.Youssef等为了研究207个产表活菌株分别进行好氧和厌氧培养后提取表面活性剂发现，芽孢杆菌类主要产脂肽类表面活性剂，其表面活性与结构存在重要相关，尤其是脂肽的脂肪酸的含量[41]。国内采用离子诱变获得的突变菌株的分子量1 022 Da的环脂肽类表面活性物质比国内外研发的1 036 Da环脂肽少一个亚甲基(-CH2)，其表面活性更强，CMC 值仅为1 μM，在浓度低至20 μM 就可将水的表面张力从72 mN/m降低到27 mN/m，是有文献记载的最强的生物表面活性剂[3,16]。

目前，生物表面活性剂只有少数产品走向市场，大多数品种还都处于实验研究阶段，还没有进行大规模的工业化生产，这主要是由于生产成本较高。而决定生物表面活性剂生产成本的主要因素有菌株、原料、发酵工艺和下游技术等，其中菌株是重中之重。只有不断改进物理因素诱变手段在内的菌株改良技术，不断培育可低成本发酵、品质优良、抗逆性好的高产菌株，才能大幅度提高生物表面活性剂与化学表面活性剂的性价比，为生物表面活性剂的推广奠定良好基础。而物理因素的诱变技术由于成本低、起点低、易在基层单位和企业推广等优点，即使在基因工程技术大发展的今天，仍有旺盛的生命力和应用价值，尤其是新型物理因素的诱变技术，更是值得大力推广。目前作者所在的石油地质微生物技术课题组，应用离子束在内的诱变源，对自有的石油微生物进行诱变改良，取得了良好的效果，可望在不久即获得稳定的高产菌株，并在尽快在油田及化工等企业推广应用。

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