海藻糖合酶的作用和特点

王 宁

(沈阳师范大学,辽宁,沈阳,110034)

1 海藻糖合酶的作用机制

由于尚未得到海藻糖合酶的蛋白晶体结构,目前对海藻糖合酶作用机制的研究仅仅局限于理论推测阶段。日本的科学家首先证明了海藻糖合酶的催化反应是分子内的重排过程,而不是分子之间的反应。他们利用麦芽糖作为底物,并同时在反应体系中加入 14C标记的葡萄糖,试验结果显示,并没有具有放射性的海藻糖或麦芽糖的生成。随后,韩国的科学家通过电喷雾质谱法进一步证明了这点。据报道,海藻糖合酶氨基酸序列的比对分析发现,海藻糖合酶具有α-淀粉酶家族酶类所具有的四个保守区:分别是 I XDXXXNH,II GXRXDXXZZ,IIIXXX(G/A)EZZZ, IV XXBBHD(X为疏水性氨基酸残基,B为亲水性氨基酸残基,Z为影响酶反应特异性的氨基酸残基)。据此推测,海藻糖合酶是α-淀粉酶家族成员之一。属于α-淀粉酶家族的酶类具有相似的催化机制,在 II区和 III区中存在酶催化反应的活性中心:III区中的 Glu为质子供体,将一个质子传递给底物 1,4-糖苷键中的 O原子;II区的 Asp为亲核试剂,攻击底物糖分子中的异头中心碳原子,使 C1-O键断裂。而 I区和 IV区中的 His介导底物和酶分子的结合根据α-淀粉酶家族酶类的催化机制,研究人员推测海藻糖合酶通过催化两次取代反应完成麦芽糖和海藻糖的相互转变过程。首先,麦芽糖分子与酶的催化部位相结合,酶活性中心的 Glu将一个质子传递给1,4-糖苷键中的 O原子,与此同时 Asp攻击 C1-O-C4中的 C1原子,形成盐离子的过渡态。从而发生第一次取代反应,使麦芽糖分子中 C1-O键的断裂,产生β-葡糖基 -酶的中间体。在此之后,酶的构象会发生变化,使得另一个游离的葡萄糖分子的相对位置发生改变,其 C1-OH正好能够亲核攻击葡萄糖基 -酶中间体上的 C1原子,发生第二次取代反应,产生α,α-1,1-海藻糖。某些海藻糖合酶,将麦芽糖转化为α,α-海藻糖的同时还会有少量的α,β-海藻糖(约 3%)生成,这说明在β-葡糖基 -酶的中间体形成后,酶分子可以改变为另一种构象,使得游离的葡萄糖分子在酶活中心内部以另一种空间位置发生第二次取代反应。如果水分子进入酶活中心,并作为亲核试剂优先攻击β-葡糖基 -酶的中间体上的碳原子,则会形成副产物葡萄糖,即发生双糖的水解。通过定点突变的方法将红色亚栖热菌的海藻糖合酶分子中的催化位点 Glu和 Asp突变为丙氨酸,结果显示突变酶几乎没有活性,证明了这些位点对酶活的重要性。海藻糖合酶催化麦芽糖和海藻糖相互转化的可逆反应,麦芽糖和海藻糖都可以作为海藻糖合酶的底物。

2 嗜热菌海藻糖合酶的结构特点

嗜热菌的海藻糖合酶具有较高的最适反应温度和很强的热稳定性,其蛋白的分子量也较其他细菌中的海藻糖合酶大很多,嗜热菌的海藻糖合酶比其他海藻糖合酶具有一个多余的 C端结构域。科学家也通过实验证明了这种 C端结构域能够增加海藻糖合酶的热稳定性,并降低反应中副产物葡萄糖的生成。通过对嗜热栖热菌海藻糖合酶的 C端结构域缺失体酶活性质的研究,发现 C端结构域的缺失不会影响酶的活性,但是酶的最适温度和热稳定性都有所降低。而将耐放射异球菌的海藻糖合酶与该 C端结构域的融合表达后,酶的最适温度和稳定性都被显著提高了。此外,C端结构域可以使酶的构象发生一定程度的变化,产生更为牢固紧密的构象,使得水分子难以进入活性中心,从而降低了副产物葡萄糖的生成。

3 海藻糖合酶在生物体内起到的作用

通过对已经纯化或异源表达的海藻糖合酶特性的研究,发现在细胞体外海藻糖合酶的可逆反应是向着有利于生成海藻糖的方向进行的,那么细胞体内的情况是否也如此呢?随着对海藻糖合成途径研究的深入,发现某些细菌体内具有两条或 3条海藻糖合成途径。通过实验发现,在高渗、超氧和酸性等外界环境压力下,TPS和 TPP蛋白的合成水平明显提高,而 TreS蛋白的合成量没有变化或略有降低。这说明在外界压力下,海藻糖主要是由 TPS/TPP途径合成,而 TreS的作用是将细胞内积累的大量的海藻糖转化为麦芽糖。在麦芽糖葡糖基转移酶的作用下,麦芽糖被合成为麦芽寡糖基多糖,并释放出葡萄糖。葡萄糖被磷酸化后进入糖酵解途径。研究结果说明大量的海藻糖对细菌的生长有一定的毒性作用,因此海藻糖的分解代谢对细胞的生长具有非常重要的作用

4 结语

虽然尚未得到海藻糖合酶的蛋白晶体结构,对其催化机制的研究只限于理论推测水平。可是随着蛋白结晶技术的发展,相信在不久的将来我们会得到海藻糖合酶的蛋白晶体结构,并对其催化机制作出更深入的解释。海藻糖合酶已经被广泛应用于海藻糖的工业生产,并大大降低了海藻糖生产的成本,但如何进一步提高海藻糖合酶的酶活力和转化率仍然是目前研究的热点。利用生物信息学的知识,通过饱和突变或定点突变技术对海藻糖合酶基因进行遗传学改造,改变酶活性中心附近以及与热稳定性相关的氨基酸序列,极有可能获得酶活更高和稳定性更高的海藻糖合酶。

[1]韦宇拓,黄日波,蒙健宗,等.谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法.中国:200410013006.9.2005.

[2]韦宇拓,黄日波,蒙健宗,等.耐放射性异常球菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法.中国:200410013008.8.2005.