血红素的应用与提取方法

马志科,昝林森

(西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵 712100)

血红素的应用与提取方法

马志科,昝林森

(西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵 712100)

血红素是血红蛋白、肌红蛋白等的辅基,具有重要的生理功能,在医药、食品等方面得到广泛应用。论文介绍了血红素的冰醋酸提取法,酸性丙酮提取法、羧甲基纤维素提取法、酶解提取法、血粉提取法、有机酸和有机碱混合提取法。

血红素;制备工艺;应用

血红素(heme)是血红蛋白组成不可缺少的组分,它是由原卟啉IX与Fe2+结合而成,与珠蛋白结合成血红蛋白。它在体内主要的生理功能是载氧,除在血红蛋白、肌红蛋白中担负O2和CO2运输外,还是细胞色素 P450和过氧化物酶的辅基。自1885年俄国学者用冰醋酸和氯化钠与牛血共热提取血红素结晶以来,人们对血红素的研究不断探索,从血红素的结构到理化性质,从生理功能到制备工艺等进行了深入研究[1]。血红素是含铁的卟啉化合物,铁原子位于卟啉环的中央,具有共轭结构,性质稳定。不溶于水、稀酸、氯仿、醚及丙酮,而溶于氢氧化钠溶液或氨水及热醇中。血红素的分子简式为C34H33FeN4O4,分子质量为633.49 u。血红素为片状或针状的紫色结晶,因纯化溶剂不同,还会有其他颜色。近些年来,血红素在医药、食品等方面的应用研究有较快的进展,同时也促进了血红素制备工艺的不断发展与完善。本文对近些年血红素的应用及提取方法做一介绍。

1 血红素的应用

1.1 作为补铁药物和食品添加剂

法国人最早尝试用硫酸亚铁治疗缺铁性贫血,但其吸收率只有1%～3%,而且严重刺激肠胃,引起肠胃不舒,有明显的副作用。血红素作为有机铁,能被人体很好的吸收,无副作用等优点。临床研究证明[2-4],血红素是很好的补铁药物,对缺铁性贫血有明显的治疗作用。在食品工业上,血红素可用于食品添加剂[5],若将血红素修饰后制成色素,可作为食用色素等[6-7]。

1.2 溶解疟原虫

血红素具有溶解疟原虫的作用。Banyal H S研究发现,从鼠红细胞中分离的疟原虫能被氯化高铁血红素或氯喹-血红素复合物溶解。试验研究表明,单一的氯喹不能引起疟原虫的膨胀或溶解,而氯喹与血红素形成复合物后能溶解疟原虫,伴随溶胀,谷氨酸脱氢酶从疟原虫中释放,显示了胞内容物的丧失。血红素浓度越高,酶的释放也越多[8]。

1.3 血红素应用生物化学分析研究

血红素还广泛应用生物化学分析研究,李任强[9]用堕性载体sepharose 4B、微晶纤维素、人造沸石和琼脂糖分别直接固定氯化血红素,装柱后应用于痕量过氧化氢酶的检测,同时利用葡萄糖氧化偶联模拟过氧化氢酶法用于葡萄糖检测。结果表明,以上几种载体经活化后均能很好的固定血红素,固定化的血红素装柱后保持稳定的催化过氧化氢酶的活性,检测灵敏度高。灵敏度大小为:Sepharose 4B＞琼脂糖＞微晶纤维素＞人造沸石。朱立等[10]采用血管环灌流装置,试结果表明,SD大鼠腹腔注射高铁血红素后,主动脉HD-1活性和血中CO含量增高,同时,H2O2引起的血管收缩功能下降的现象明显改善。

1.4 诊治癌症

血红素经除铁处理后,对其侧链进行修饰可以得到一系列卟啉类药物——光卟啉及原卟啉等衍生物。这些衍生物对恶性肿瘤细胞具有特殊亲和力,尤其对紫色激光反应敏感,在红色激光作用下,血卟啉产生自由基而杀死癌细胞[11]。因此,血红素衍生物具有诊断和治疗的双重作用,显示了在肿瘤诊治中的重要性。

2 血红素提取方法

2.1 冰醋酸提取法

俄国学者Schalteieff(1885)最早在实验室内用冰醋酸、氯化钠与牛血共热,提取分离得到血红素结晶。此法开创了血红素制备的先河,在此基础上学者进行了一些改进,目前仍在实验室和工业化生产中使用。其原理是冰醋酸能溶解大部分血红蛋白,而在酸性条件下分解为珠蛋白和血红素,因血红素在冰醋酸环境中不溶解而被分离。钟耀广[12]对冰醋酸提取血红素的工艺进行了改进,对冰醋酸加入量,反应条件,氯化钠加入量进行了系统研究。在配有回流冷凝管的三角烧瓶中先加入冰醋酸和氯化钠,加热使氯化钠溶解,为避免血液碰到烧瓶的壁上,再以细流加入抗凝猪血球。在105℃下保持40 min,让反应液冷却到室温后,进行分离处理,得到粗血红素。

2.2 酸性丙酮提取法

Lindroos(1975)提出使用酸性丙酮分离提取血红素的方法,根据血红素与珠蛋白的结合在pH＜3时最为疏松,极易被有机溶剂提取出来的原理。丙酮使蛋白凝固沉淀,同时血红素呈溶液状态进入丙酮相。用抽滤的方法使固液两相分离,对液相进一步处理得到血红素。杨淑琴[13]利用此法从猪血中分离血红素。刘任民等[14-15]先用超声波对红细胞溶血,再用酸性丙酮提取血红素。杨红等[16]对鸵鸟血经酸性丙酮,提取后,加10 g/L的NaAc搅拌均匀,静止后血红素呈无定形沉淀,抽滤,干燥即得血红素成品。还可用鞣酸沉淀,加50 g/L的鞣酸搅拌,静置过夜,血红素呈结晶状析出,抽滤水洗结晶,干燥得血红素。庄红等[17]对血红素纯化及亚铁保护方面作了进一步研究。

2.3 羧甲基纤维素(CMC)提取法

1983年芬兰科学家使用羧甲基纤维素(CMC)提取血红素,羧甲基纤维素是一种半合成的高分子阳离子型纤维素,其功能集团为羧甲基。由于它有极大的表面积和多孔结构,故易于吸附血红素而与血红蛋白分离。该法用盐酸调节pH使血红蛋白溶液达到pH3.0,再加入适量浓度的CMC溶液,由于纤维素的特殊构型,其有效交换集团空间较大,进行充分搅拌,使其较大容量吸附血红素。用离心机分离,达到与CMC结合的血红素分离出来的目的。CMC血红素,由于CMC已混入血红素中,纯度相对较低,它可直接作为一种安全有效的补铁添加剂。王超英[18]改进了羧甲基纤维素提取血红素的方法,结果表明,只要选择适当的CMC用量,与之相适应的pH条件,就可得到较高的CMC血红素。

2.4 酶解提取法

用蛋白酶水解血红蛋白制取血红素,避免了使用有机溶剂,被认为是目前最环保的一种提取血红素的方法。该法是利用蛋白酶先将血红蛋白水解成水溶性的氨基酸和多肽,再将不溶于水的血红素离心分离。张亚娟等[19]以猪血为原料,选用多种蛋白酶水解血红蛋白制取血红素,选用资料[20]提供方法测定水解度。结果表明,碱性蛋白酶的水解能力最强,其次是中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶,风味酶的水解能力最弱。选用碱性蛋白酶Alcalase,筛选出最佳工艺参数为最适pH为7.5,温度为60℃,底物浓度为40 mL/L,加酶量为40 mL/L,离心分离后,得到血红素粗品。杨锡洪等[21]采用酶法水解血红蛋白制备亚铁血红素肽,血红蛋白经蛋白酶处理,去掉一些不需要的肽链、保留维持血红素铁稳定的肽链,分离后得到血红素铁的复合体,可直接添加到食品中作为补铁剂,是一种较好的利用途径。

2.5 血粉提取法

采用低温干燥的血粉为原料,用醋酸配制酸性丙酮作为提取溶剂,充分搅拌提取后,过滤去沉淀,再将沉淀重复提取,滤液真空浓缩,即析出血红素。周淡宜等[22]采用该法将沉淀的血红素,用28 g/L氨水溶液溶解后,用酸调pH至中性,沉淀析出后用水洗3次,干燥后得到纯度较高血红素。该法的优点为节约试剂,克服了新鲜血液的运输、贮存困难。还能进一步回收有机试剂丙酮,产品成本降低,为规模化生产血红素提供了一种新的生产工艺。

2.6 有机酸有机碱混合溶液提取法

姜传福[23]提出了采用有机酸HA-有机碱BOH的混合溶液作为溶剂,对猪血中血红素提取的新方法。混合溶剂可发挥各自优势,相辅相成,增强提取效益。以强碱调节pH为5～6时,血红素即可析出,血红素产率为5 g/L血液。该法与其他方法比较,工艺流程简单、无污染、成本低,经济效益明显。是一种既经济又环保的新方法,拓展了血红素制取的新工艺,为血资源利用提供了一条新的途经。

3 血红素提取方法评价及发展趋势

提取血红素的方法除以上介绍,还有表面活性剂法,盐酸萘乙二胺法等,这些方法都有各自优缺点。冰醋酸法,收率低,冰醋酸试剂回收困难,成本较高,但提取方法简单实用。酸性丙酮法,试剂成本较高,但工艺技术趋于成熟,可得到纯度较高的血红素。如用鞣酸制备血红素纯度可达90%以上,还有红紫色晶体,但收率低,且鞣酸价格较高,不能回收,不适应规模化生产。而CMC法、酶法只能得到粗品,但工艺流程简单,在整个制备工艺中不使用有毒试剂,成本低,可作为补铁剂或食品添加剂直接应用。在实际制备时选用哪种方法,要由血红素的用途而定。今后发展趋势是血红素联产其它相应产品,对动物血液的综合开发利用。提取血红素用血细胞为材料,血浆可以作水解蛋白之用,还可以加工制备成血浆蛋白粉[24]。提取血红素后剩余部分变性蛋白可用作饲料添加剂[25],还可以进一步水解得以氨基酸、多肽和蛋白胨等。物尽所用,降低生产成本,减少环境污染。

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Application and Preparation Techniques of Heme

MA Zhi-ke,ZAN Lin-sen

(College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Y angling,Shaannxi,712100,China)

heme,the prosthetic group of the hemoglobin and myoglobin,has been used widely in medical and food science ete.The preparation techniques of heme were introduced and reviewed in this paper.Different extracting methods were currently used:acetit acit method,acid acetone method,carboxymethyl cellulose method,enzymatic hydrolyis method,blood pouder method,organic acid and organic base method.From what has been introduced above,it is the devlpment tends that heme has been combined production and animal blood has been devlpoed synthetically.

heme;preparation tecnidque;application

Q513

A

1007-5038(2010)09-0112-03

2010-07-01

国家自然科学基金项目(30871788)

马志科(1960-),男,陕西武功人,硕士,高级实验师,主要从事教学实验及科研工作。