鸭疫里氏杆菌分子生物学研究进展*

刘佳丽,张喜宏,姜英武,谷春华,高云航*

(1.吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;2.吉林省敦化市牧业管理局,吉林敦化133700)

鸭疫里氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎,是一种由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染引起家鸭、鹅、火鸡等多种家禽广泛性纤维素性渗出为特征的急性或慢性传染病。亦有报道从野禽和家养猪中分离到本菌[1]。本病目前呈全球性发生,发病率和病死率均较高,对养鸭业造成严重经济损失。RA血清型众多,且各血清型之间无交叉保护力。目前公认有21个型(1～21型),并不断有新的血清型被发现[2]。目前国内外学者均致力于本病致病机理、耐药机理、免疫原性等病原分子生物学方面研究。

1 毒力相关基因的研究

RA感染是一个复杂、动态的多因子作用过程,涉及众多毒力基因产物即毒力因子的协同作用。目前国内外对毒力相关基因研究尚处于起步阶段。

1.1 质粒

Chang C F等[3]首次报道大部分RA菌株含有质粒,并将其中一个3.9 kb的质粒命名为pCFC1,包含4个长的开放阅读框(ORF)即VapD1、VapD2、RepA1和RepA2。其中VapD1和VapD2编码的蛋白质与毒力有关,并且证明VapD1序列仅存在于含质粒的RA菌株中。Weng S C等[4]从大小为5.6 kb的质粒pCFC2中发现一个插入序列元件ISRal,为编码毒力相关类蛋白基因,并且为首次在革兰阴性菌中发现的插入序列。

1.2 环化腺苷-磷酸溶血素-唾液酸蛋白酶

Crasta K C等[5]建立了RA基因文库,通过金黄色葡萄球菌进行环化腺甘-磷酸CAMP反应筛选阳性克隆,获得协同溶血素基因cam,并证明其为一种中性金属蛋白基因,经SDS-PAGE和Western blot分析,表达产物为37 ku的唾液酸蛋白酶。CAMP可能为RA毒力决定因子,其cam基因为所有RA毒株所共有。CAMP活性可被螯合剂等抑制,具有免疫原性,并可协同产生溶血作用。

1.3 二肽肽酶Ⅳ(dppⅣ)及锌依赖肽酶(zdp)

郑娟[6]用选择性捕获转录序列(SCOTS)技术筛选1型鸭疫里氏杆菌(RA-YM)在感染过程中特异性表达基因,筛选到2个编码蛋白酶的基因,即二肽肽酶Ⅳ(dppⅣ)和锌依赖肽酶(zdp)。推测二肽肽酶Ⅳ可能为RA引起主要病理变化——腹腔浆膜面广泛性纤维素性渗出的关键性毒力因子之一。

1.4 Ⅰ型磷酸二酯酶(PDE1)基因

陈虹[7]应用血清Ⅰ型RA CH-1株表达型DNA文库进行免疫筛选,筛选出一段4 434 bp的插入DNA片段。同源性分析表明,该基因是一种新的Ⅰ型磷酸二酯酶(PDE1)基因,对其进行重组及原核表达,诱导表达出大小约为80 ku的PDE1重组蛋白。免疫印迹检测结果表明该重组表达蛋白具有较好的免疫原性。

1.5 明胶水解酶

多种细菌分泌的具有水解明胶活性的胞外蛋白酶与致病性有关,为重要毒力因子。RA部分菌株具有液化明胶特性。唐妤[8]对RA部分特性研究,RA明胶水解粗酶对试验鸭肝脏、大脑、心脏、脾脏可以造成一定病理性损伤。李继祥等[9]从RA AF株培养滤液中分离获得能水解明胶及改变细胞形态的活性蛋白质,分子质量约为55 ku,证实为降解明胶的蛋白水解酶,是鸭疫里氏杆菌培养滤液影响鸭胚成纤维细胞形态的活性物质,可能是细菌毒力因子之一。

1.6 热休克蛋白Hsp20和转座酶

刘燕等[10]应用双向电泳及质谱技术对血清2型鸭疫里氏杆菌强毒株及其体外传代200代(RA200)的弱毒菌株外膜蛋白进行比较蛋白质组学研究,获得重复性好的差异表达蛋白质点数3个,经胶内酶解和肽质量指纹图谱分析,W1为热休克蛋白Hsp20家族成员,W2、W3为转座酶,推测它们可能与里氏杆菌的毒力密切相关。

2 耐药相关因子的研究

细菌耐药性的产生机制分为自发性基因突变和耐药基因掺入,细菌耐药基因不仅由其染色体携带,还常由染色体外的质粒、转座子(transposon,Tn)或整合子(integron,int)携带,通过融合、转导和转化在不同种属的遗传物质之间转移或集聚重排造成多重耐药菌发生率大幅上升。从临床实践可以看出,由于大量抗生素及抗菌药用于治疗鸭疫里氏杆菌病,造成鸭RA耐药现象日益增多,耐药率高且广泛,交叉耐药性多[11]。

2.1 氨基糖苷类修饰酶-3′核苷转移酶I

刘颖等[12]首次在RA中检测出了氨基糖苷类修饰酶——3′核苷转移酶Ⅰ(ant(3′)-Ⅰ)基因,产生氨基糖苷类耐药的基因是通过氨基糖苷类修饰酶(AMES)对进入胞内的活性分子进行修饰使之失去生物活性。此研究对RA产生氨基糖苷类抗生素耐药的分子机制提供了基础。

2.2 螺旋酶gyrA

刘颖等[13]用PCR技术扩增26株RA的部分螺旋酶gyrA序列,通过与大肠埃希菌(ABA36537)比较氨基酸序列找到了对喹诺酮类抗菌药耐药菌株的基因突变点和突变规律,为研究RA对喹诺酮类抗菌药耐药的分子机制提供了基础。孙亚妮[14]对临床分离的31株RA,对其螺旋酶区进行测序,寻找RA对喹诺酮类抗菌药耐药菌株的gyrAQDRD突变热点和突变规律。结果表明,31株诺氟沙星耐药菌株均出现了gyrA基因突变,而环丙沙星耐药菌株基因突变没有明显规律性。

2.3 基因盒-整合子系统

蔡秀磊[15]应用PCR技术对鸭疫里氏杆菌浙江分离株进行基因盒-整合子系统检测。从分子水平上研究该菌耐药性产生与传播机制。整合子可变区扩增得到两种大小不同基因盒,长度分别为1 048 bp(InI-A)和2 352 bp(InI-B)。InI-A中含有一个耐药基因盒aadA5基因,编码核苷转移酶,导致细菌对氨基糖甙类药物产生耐药性。InI-B含有长度为555 bp的aac6-Ⅱ基因,编码酰基转移酶,引起细菌对氨基糖苷类药物耐药;长度为633 bp的catB3基因,编码氯霉素乙酰转移酶,介导对氯霉素产生耐药性;长度为792 bp的aadA1基因,编码核苷转移酶,介导对氨基糖苷类药物耐药。以上结果表明,RA存在与其他细菌同源性极高的Ⅰ型整合子结构,推测认为与分离菌株多重耐药性有关。

2.4 生物膜的研究

很多微生物的耐药性与生物膜的产生息息相关[16]。Hu Q H等[17]发现,RA中的生物膜对抗生素和去污剂有很好的抵抗作用,同时认为生物膜的产生是造成RA持续感染的重要因素。

2.5 双耐药RA融合菌株的构建

蔡良水[18]采用原生质体融合技术构建双耐药RA融合菌株,分别选用氯霉素(Chi)和红霉素(Ery)对RA-JX菌株(l型)和RA-2菌株(2型)进行耐药性标记,分别获得遗传特性稳定的耐药性标记菌株RAC(Chlr,Erys)(1型)和RAE(Eryr,Chls)(2型)。鸭疫里氏杆菌血清1型和2型双耐药融合菌株的成功构建,为鸭疫里氏杆菌新型疫苗的开发奠定了理论基础。

3 DNA指纹图谱技术的应用

Rimler R B等[19]将17种限制性核酸内切酶用于RA的DNA指纹图谱研究,发现不同来源RA基因存在明显差异,即使来自同一地区同一禽类的分离株相同血清型RA菌株,其DNA指纹图谱也有所不同。Huang B等[20]通过回文结构序列PCR(repetitive sequence based-PCR,Rep-PCR),以基因外重复回文序列为引物,对18个血清型35株RA进行基因外重复,发现不同血清型Rep-PCR指纹图谱呈现多态性,相同血清型而流行病学上不相关的菌株经Rep-PCR扩增后的指纹图谱也存在不同。结果表明Rep-PCR技术也许可以成为对RA血清亚型鉴定的一种分子工具。程龙飞等[21]以Rep-PCR技术,将分属于8个血清型40株RA区分为12个不同基因型,不同血清型RA图谱有明显差异,相同血清型RA图谱也有所不同。

4 16 S rDNA特性分析

Subramaniam S等[22]通过对4株RA编码16 S rRNA的基因序列进行比较分析,发现其基因序列相似,同源性高达99%～99.5%。其16 S rRNA基因经限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)表明即使是同一血清型不同RA菌株,其16 S rRNA基因仍有差异。

5 RA相关免疫蛋白

RA免疫相关蛋白的研究主要集中在荚膜蛋白和外膜蛋白(OmpA)。

5.1 荚膜蛋白

苏敬良等[23]对1型RA荚膜提取物免疫原性结果表明,荚膜粗提物和经过苯酚抽提纯化后的荚膜提取物均能有效刺激鸭机体产生抗体,对同源细菌攻毒保护率分别为90%和70%。粗提荚膜可直接诱导机体产生免疫反应,而荚膜多糖分子纯化过程中构型可能发生改变,从而影响其免疫原性。齐冬梅等[24]用盐浸法提取I型RA荚膜粗提物并制成油佐剂疫苗,获得较好免疫保护效果(9/10)。

5.2 外膜蛋白

朱德康[25]对5种血清型RA外膜蛋白(OmpA)SDS-PAGE图谱比较分析结果表明,其外膜蛋白电泳图谱具有一定相似性,不同血清型菌株外膜蛋白之间存在交叉免疫原性,74 ku和31 ku外膜蛋白是重要交叉免疫原性蛋白。程安春等[26]采用超声波裂解法和超速离心法提取血清2型RA外膜蛋白,经过透射电镜观察、免疫印迹证实,血清2型RA 40 ku外膜蛋白为主要免疫原蛋白,用分离的外膜蛋白加上弗氏佐剂制备的亚单位疫苗免疫雏鸭后,可诱导产生较强的抗体。刘文华等[27]等利用PCR技术扩增标准血清2型RA 42 000外膜蛋白基因片段(OmpA-2)1 045 bp,并将其克隆和表达,获得分子质量约为65 ku融合表达蛋白。霍翠梅等[28]参照已知RA OmpA序列设计1对特异性引物,经PCR扩增得到目的片段约1 200 bp,经测序与标准序列核苷酸同源性达99.8%;诱导表达后,经SDS-PAGE分析表明,OmpA获得高效表达,Western blot检测发现与1、2、10、11型全菌兔血清呈阳性,而与阴性兔血清不反应,说明表达蛋白具有高度免疫反应特异性。

6 随机扩增多态性DNA(RAPD)技术

汪铭书等[29]以4株不同血清型RA、5株不同血清型鸭源致病性大肠埃希菌和5株同一血清型鸭沙门菌为研究对象,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对其基因组DNA进行分析,筛选出一条引物G12,结果显示电泳图谱中535 bp的条带为鸭疫里氏杆菌所特有,330 bp条带为沙门菌所特有,1 227 bp条带为大肠埃希菌所特有,表明G12可作为分子标记用来鉴别3种细菌。

7 单克隆抗体的制备

覃志初等[30]首次尝试RA单克隆抗体(McAb)的研制,成功的研制出RA外膜蛋白McAb,并建立了灵敏度高、特异性好的RA单克隆抗体筛选方法,为RA单克隆抗体在鸭传染性浆膜炎的防治及相关研究打下基础。

8 基因文库的构建

目前关于RA基因文库构建的研究较少,仅对1型、2型RA进行部分基因库构建,具有一定成效,可为进一步研究RA的致病和耐药机制提供依据。

朱德康等[31]以血清1型RA CH21株为材料,成功构建其部分基因组文库,研究发现其含有1个编码369个氨基酸的完整开放阅读框架,为尚未见报道的RA基因序列,且存在多个预测抗原表位。吴芳等[32]以RA 2型毒力株RA F2及弱毒力株LY-58为研究对象,通过抑制性差减杂交(SSH)技术,构建DNA差减文库,从RA F2株中获得14个特异性差异基因片段。经同源性分析,其中6个差异基因片段分别与外膜蛋白、ATP结合蛋白、转录调节因子、氨基酸通透酶、胞外蛋白编码基因具有同源性,为可能毒力基因。利用PCR对差异基因片段在不同血清型RA中的分布进行检测,结果表明,除8型外,以上差异基因片段在RA中分布普遍。

9 原生质体的制备

原生质体比较特殊,外源DNA比较容易进入细胞内,制备原生质体后再进行转化是一个非常好的选择,特别对于那些难以转化的细菌来说提供了一条新途径,转化成功的关键在于原生质体的制备。RA是一种非常难以转化的细菌,国内外未见关于其质粒转化的报道。王勇等[33]试验以鸭疫里氏杆菌OD600为0.7时为受体菌,在高渗缓冲液中,经溶菌酶5 mg/mL于37℃作用50 min,制备的原生质体再生于再生双层固体培养基,原生质体成功再生。此研究为RA的质粒转化提供了一条新途径。王春平等[34]以耐药标记的RA TXRA1(Chlr,Erys)为亲本菌株,在DNase I始终存在的条件下,采用Lysozyme-EDTA法制备原生质体,然后在高渗琼脂平板上再生,成功获得了92%的原生质体制备率和38.77%的再生率。

10 噬菌体技术的应用

程龙飞等[35]探索RA生物学疗法,对健康番鸭粪便进行分离富集,获得1株RA敏感的烈性噬菌体,命名为RA P15。该噬菌体可裂解2株鸭疫里氏杆菌(RA f6和RA f71),说明噬菌谱较窄。透射电镜观察显示,该噬菌体由呈多面体的头部(直径约55 nm)和细长的尾部(长约200 nm)组成。RA P15基因组可以被DNaseⅠ消化,但不能被RNaseA和绿豆核酸酶消化,提示其核酸类型为双股DNA。形态学和分子特征提示,RA P15属于长尾病毒科。

[1] 刘传华,赵艳丽,王玉海,等.鸭疫里默氏菌研究进展[J].动物医学进展,2008,29(5):91-93.

[2] Kiss I,Kardos G,Nagy J,et al.DNA fingerprinting of Riemerella anatipestifer isolates from ducks[J].Vet Rec,2007,160:26-28.

[3] Chang C F,Hung P E,Chang Y F.Molecular characterization of a plasmid isolated from Riemerella anatipesti fer[J].Avian Pathol,1998,(27):339-345.

[4] Weng S C,Chang C F,Chang Y F.Identification of a virulence-associated protein homolog gene and ISRal in a plasmid of Riemerella anatipester[J].FEMS Microbiol Lett,1999,179(l):11-19.

[5] Crasta K C,Chua K L,Subramaniam S,et al.Identification and charaeterization of CAM P cohemolysin as a potential virulence factor of Riemerella anatipesti fer[J].J Bacleriol,2002,184(7):1932-1939.

[6] 郑 娟.利用SCOT S技术筛选鸭疫里氏杆菌体内外差异表达的基因[D].湖北武汉:华中农业大学,2008.

[7] 陈 虹.鸭疫里默氏杆菌1型磷酸二酯酶基因的发现及其克隆表达和应用研究[D].四川雅安:四川农业大学,2008.

[8] 唐 妤.鸭疫里默氏杆菌明胶水解酶部分特性研究[D].重庆:西南大学,2007.

[9] 李继祥,唐 妤,黄承洪,等.鸭疫里默氏杆菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响[J].中国兽医科学,2008,38(5):370-373.

[10] 刘 燕,韦 强,鲍国连,等.鸭疫里默氏杆菌强、弱菌株外膜蛋白的比较蛋白质组学研究[J].生物化学与生物物理进展,2008,35(6):691-694.

[11] 吴 华,李胜利,侯百枝,等.鸭疫里氏杆菌病药物防治研究进展[J].动物医学进展,2007,28(4):96-100.

[12] 刘 颖,苏敬良,刘文华.鸭疫里氏杆菌九种氨基糖苷类修饰酶基因的检测[J].中国家禽,2006,28(24):143-145.

[13] 刘 颖,苏敬良,刘文华.鸭疫里默氏菌的gy rA基因的检测与变异位点的分析[J].中国兽医杂志,2007,43(1):12-14.

[14] 孙亚妮.GN52株鸭疫里氏杆菌的传代培养和鸭疫里默氏杆菌分离株耐药性的研究[D].山东泰安:山东农业大学,2008.

[15] 蔡秀磊.鸭疫里默氏杆菌耐药性与耐药基因研究[D].山东泰安:山东农业大学,2007.

[16] Stewart P S,Costerton J W.Antibiotic resistance of bacteria in biofilms[J].Lancet,2001,358:135-138.

[17] Hu Q H,Han X G,Zhou X J,et al.Characterization of biofilm formation by Riemerella anatipesti fer[J].Vet Microbiol,2010,144(3/4):429-436.

[18] 蔡良水.鸭疫里氏杆菌双耐药融合菌株的构建[D].湖北武汉:华中农业大学,2008.

[19] Rimler R B,Nordholm G E.DNA fingerprinting of Riemerella anatipestifer[J].Avian Dis,1998,42(1):101-105.

[20] Huang B,Subramaniam S,Chua K L,et al.Molecular fingerprinting of Riemerella anatipestifer by repetitive sequence PCR[J].Vet Microbiol,1999,67(3):213-219.

[21] 程龙飞,李文杨,施少华,等.鸭疫里默氏菌基因分型[J].中国兽医学报,2004,24(6):545-547.

[22] Subramaniam S,Chua K L,Tan H M,et al.Phylogenetic position of Remerella anatipestifer based on 16 s rRNA gene sequences[J].Int J Syst Bacteriol,1997,47(2):562-565.

[23] 苏敬良,郭玉璞,吕艳丽,等.鸭疫里氏杆菌免疫原性研究[J].中国兽医杂志,1998,24(1):8-10.

[24] 齐冬梅,赖月辉,巫月生,等.Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌荚膜免疫的研究[J].中国兽药杂志,2009,43(4):17-19.

[25] 朱德康.五种血清型的鸭疫里氏杆菌外膜蛋白特性比较及其免疫原性的研究[D].四川雅安:四川农业大学,2003.

[26] 程安春,汪铭书.血清2型鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白多肤的组成及其免疫原性[J].中国兽医学报,2004,24(4):329-332.

[27] 刘文华,苏敬良,王晓雷.2型鸭疫里默氏菌42000外膜蛋白的克隆与表达[J].中国兽医学报,2008,28(4):379-382.

[28] 霍翠梅,韦 强,鲍国连,等.鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A的克隆与表达[J].浙江农业学报,2008,20(2):92-95.

[29] 汪铭书,程安春,李淑梅,等.鸭疫里氏杆菌鸭源致病性大肠埃希氏菌和鸭沙门菌的RAPD研究[J].中国兽医科技,2004,34(10):3-8.

[30] 覃志初,张任娜,帅 领,等.抗鸭疫里氏杆菌OMP单克隆抗体间接ELISA筛选方法的建立[J].中国兽医杂志,2009,45(2):23-24.

[31] 朱德康,程安春,汪铭书,等.鸭疫里默氏杆菌基因组文库的构建及免疫原性基因初步筛选[J].中国兽医学报,2007,27(6):384-387.

[32] 吴 芳,蔡建平,陆承平,等.用抑制性差减杂交筛选鸭疫里氏杆菌2型可能毒力基因[J].南京农业大学学报,2008,31(4):102-106.

[33] 王 勇,马 跃,赵 秦,等.鸭疫里默氏杆菌原生质体的制备研究[J].现代畜牧兽医,2009(1):48-50.

[34] 王春平,韦 强,崔言顺,等.鸭疫里默氏杆菌原生质体制备与再生的研究[J].浙江农业学报,2009,21(4):311-315.

[35] 程龙飞,钟 敏,郑 腾,等.鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体的分离鉴定[J].中国兽医科学,2009,39(2):106-109.