头穴丛刺法对急性脑梗死大鼠生长相关蛋白 -43mRNA表达的影响*

客 蕊,朱文增,东贵荣,李红颖,倪金霞

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江哈尔滨 150001;3.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437;4.黑龙江省第二人民医院,黑龙江哈尔滨 150010)

头穴丛刺可以促进脑卒中患者神经功能的恢复,同时头穴丛刺的作用机制研究,也是针灸学术发展的重要问题。脑卒中是中老年常见病之一,具有高发病率、高复发率、高致死率和高致残率的特点[1]。脑梗死后超早期进行溶栓治疗可以抢救梗死灶边缘区尚未死亡的缺血神经细胞,然而梗死病灶中心神经元死亡引起的神经功能缺损至今无确切有效的治疗方法。目前,越来越多的证据表明,头穴丛刺能较大程度地降低神经功能缺损的程度和提高生活质量。急性脑梗死的病理改变包括充血、水肿、坏死,从而造成神经元细胞的缺失及功能丧失,针刺对神经元形态及功能调节、促进其恢复(结构的重构及功能的重组)具有重要意义。

生长相关蛋白 -43(GAP-43)是一种富含于生长锥中的神经组织特异性磷酸蛋白质,它广泛存在于神经组织中,尤其是在生长、分化和再生的轴突末端以及突触前膜含量极高,是一种神经轴突的生长蛋白,这种蛋白在树突上不存在。在神经元的生长、发育和再生过程中,GAP-43伴随着轴突的生长在神经组织内大量合成,参与神经递质释放的调节,被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子。本实验通过观察大鼠脑梗死及针刺后 GAP-43的动态变化,研究神经可塑性的物质基础及可能机制,并探讨针刺的影响,以便进一步指导临床治疗。

1 实验材料及方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性 wistar大鼠,体重 200～280克,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。采用随机数字表将 132只大鼠随机分为 4组：假手术组(A),模型组(B组),头穴透刺组(C组),头穴丛刺组(D组)。以上各组分成 3个时间点,即为造模 7天、14天、28天,每个时间点 11只,均做神经功能评分,取 8只做 PCR检测。

1.2 模型的建立

栓线的处理：选用直径 0.20～0.25 mm的强力钓鱼线,剪成长 40 mm的栓线,线前端经酒精灯处理形成光滑球形,在手术显微镜下观察其光滑程度,不合格的剔除,合格栓线,消毒后放入生理盐水中备用。

操作：室温条件下,大鼠称重后,用 10%水合氯醛35 mg/kg,腹腔麻醉后,仰卧固定在手术台上,颈部备皮,常规消毒后行正中切口,钝性分离并结扎右侧颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA)。钝性分离颈内动脉(ICA),备线并打一活结,在 ICA远端用微动脉夹夹闭,在 CCA分叉部切一小口,将与体重相应直径的栓线插入,收紧备线,打开动脉夹,栓线进入 ICA,轻柔推进,当线端进入 17～21 mm时可感到有一定阻力即停止推送。这样就在 ICA颅内分叉处阻断了流入大脑中动脉(MCA)的所有血液。扎紧备线,固定纤维缝合,切口局部撒消炎粉。假手术组只分离动脉,不结扎插线。模型成功的标志是：①患侧肢体的疼痛回缩迟钝或消失;②提尾倒悬时患侧上肢不能前伸;③爬行时向患侧偏斜。

1.3 治疗方法

假手术组(A)于大鼠术后清洁饲养;模型组(B)于术后清洁饲养,不予以任何治疗;头穴透刺组(C)于大鼠造模 24 h后进行头针治疗,取百会透曲鬓;头穴丛刺组(D)于大鼠造模 24 h后进行头针治疗,取百会穴及百会左、右侧各旁开 4 mm处针刺,进行快速针刺,捻转 1 min后留针 30 min,每日 1次,6天为 1个疗程,1个疗程结束后休息1天,进行下一疗程,7天组治疗 1个疗程,14天组治疗 2个疗程,28天组治疗 4个疗程。

1.4 神经功能评定

按 Bederson[2]等制定的标准评分,评分分为 4级。0级(分 )：未见行为缺陷;1级 (分)：前肢屈曲 ;2级 (分)：侧推抵抗力下降(即侧向推力实验阳性)伴前肢屈曲,无转圈行为;3级(分)：同 2级行为伴自发性旋转。

1.5 取材

各组大鼠在造模术后 7天、14天、28天时间点迅速断头取脑,暴露被覆蛛网膜的脑组织,换用经过高温高压处理、DEPC水浸泡过的器械,剔掉蛛网膜取出脑组织,置于干冰上,迅速分离各部位脑组织,分析天平称重,快速放入已标记好的冻存管内,置于液氮中保存备用,整个过程不超过 3 min。

1.6 RT-PCR法检测脑组织 GAP-43mRNA的表达

提取总 RNA;RNA逆转录;DNA聚合酶链反应(PCR)：①每个 PCR扩增管中加总量 25μL下述混合液(20μL反应体系：模板 cDNA1.0μL,5 ×缓冲液5.0 μL,10 mmol/LdNTP2.0μL,Taq酶 1.0 μL,上 、下游引物各 0.5μL,加入双蒸水至 25μL);②震荡,略离心上述混合液;③PCR扩增仪扩增。反应条件：变性,95℃30 s;退火 ,7℃60 s;延伸,59℃60 s。共做 26个循环后(根据预实验确定循环次数),72℃延伸 5 min。1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组神经功能评分

表1 各组神经功能评分比较

见表 1。经 q检验,组内不同时间窗比较：模型组在 24 h和 7天时神经功能评分比较无显著性差异(P＞0.05),但在 14天、28天时与 24 h、7天比较均具有显著性差异(P＜0.05),可见随着缺血时间的延长,模型组神经功能缺损有一定程度的自发性逐渐恢复,这可能与脑水肿的减轻、恢复再灌有关;头穴丛刺组和头穴透刺组在 28天时神经功能评分分别与 24 h、7天和14天时比较,均具有显著性差异(P＜0.05)。

组间不同时间段造模 24 h后头穴丛刺组、头穴透刺组及模型组分别与假手术组比较,均有显著性差异(P＜0.05),说明造模比较理想;而造模 24 h后头穴丛刺组、头穴透刺组及模型组各组间比较无显著性差异(P＞0.05),具有可比性。7天、14天、28天头穴丛刺组、头穴透刺组与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05);头穴丛刺组与头穴透刺组在 28天比较有显著性差异(P＜0.05)。

2.2 各组对脑梗死大鼠脑组织 GAP-43mRNA表达的影响

表2 各组脑梗死大鼠脑组织GAP-43mRNA表达的影响比较

见表 2。经 q检验,组内不同时间窗比较：头穴丛刺组、头穴透刺组、模型组在 14天和 7天比较有显著性差异(P＜0.05),在 28天时和 14天、7天比较有显著性差异(P＜0.05);

组间不同时间段比较：头穴丛刺组、头穴透刺组、模型组与假手术组在 7天、14天、28天比较均有显著性差异(P＜0.05);头穴丛刺组、头穴透刺组分别与模型组在 7天、14天、28天比较均具有显著性差异(P＜0.05),而头穴丛刺组与头穴透刺组在 7天、14天和 28天比较无显著性差异(P＞0.05)。

3 讨论

缺血性半暗带是位于梗死灶外周的缺血组织,是梗死灶周围的可以逆转的组织,此处的神经元生存还是死亡是脑梗死继续发展还是恢复的关键。脑梗死后神经功能缺损可有不同程度的自行改善,长久以来认为主要取决于脑组织和血管病变的恢复过程(侧支循环的建立、病灶周围水肿的消退、血肿的吸收、血管的再沟通等),事实上梗死半影区残存脑组织的神经可塑性起着重要作用[3]。“神经可塑性”是指神经系统在结构和功能上自身修复的能力,它是神经系统疾病,尤其是脑血管疾病治疗和康复的基础。

研究发现脑缺血早期,出现 GAP-43阳性表达减少[4]意味着 GAP-43活性下降,GAP-43的减少被认为可影响神经纤维的生长、再生及分化,从而抑制了生长锥的形成。神经元分化一旦开始,胞体和初生突起中便可见大量的 GAP-43,这显示出 GAP-43与神经发育密切的关系。

本实验研究显示：脑组织 GAP-43mRNA的表达在 7天最高,随着缺血时间的延长,脑组织 GAP-43mRNA的表达逐渐减弱,第 14天表达降低,第 28天逐渐恢复,这与文献报道是相似的。头穴丛刺组、头穴透刺组 7天、14天、28天分别与模型组比较,均具有显著性差异(P＜0.05);说明头穴丛刺组和头穴透刺组均可以促进 GAP-43mRNA的表达,而头穴丛刺组与头穴透刺组在 14天和 28天比较无显著性差异(P＞0.05),表明头穴丛刺组促进 GAP-43mRNA的表达与头穴透刺组相似。

本实验研究证实头穴丛刺可增加脑梗死后半暗区GAP-43mRNA阳性信号的表达而影响神经可塑性,其确切机制目前尚不清楚,可能同以下因素有关：①促进神经纤维的生长、再生及分化;②轴突长芽、新生突触及神经受损后的修复影响突触形态结构;③介导轴突的定向生长,启动了生长锥的形成,使其向靶组织附着、延伸;④增加神经递质的释放量伴随GAP-43磷酸化的提高。

总之,目前对于脑缺血后 GAP-43基因表达的变化及其与脑缺血后的神经再生的关系,还知之甚少。但随着研究的不断深入,必将逐步揭示脑缺血后 GAP-43基因表达的变化及其与脑缺血后的神经再生的关系。因此,该研究对于将来在临床上应用新方法促进脑缺血后的神经再生具有重大的意义。

[1] 刘波,唐强,孔妍.头穴丛刺结合康复训练治疗脑梗死患者运动功能障碍的临床研究[J].针灸临床杂志,2009,25(10)：32

[2] Risedal A,Zeng J,Johansson BB.Early training mayexcerbate brain damage in focal brain ischemia in the rat[J].J Cereb Blood FlowMetab,1999,19(9)：99721003

[3] Johansson BB,Grabowski M.Functional recovery after brain nfarction：plasticity and neural transp lantation[J].Brain Pathol,1994,4(1)：85295

[4] Velazquez RJ,Bell DF,Armstrong PF,et al.Complications of the use of the llizarov technique in the correction of limb deformities in children[J].JboneJointSurg(Am),1993,75：1148