万寿菊花中反式叶黄素提取皂化工艺的优化

王 闯，李大婧,,*，宋江峰，刘春泉

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3.国家农业科技华东(江苏)创新中心农产品加工工程技术研究中心，江苏 南京 210014)

万寿菊花中反式叶黄素提取皂化工艺的优化

王 闯1，李大婧1,2,3,*，宋江峰2,3，刘春泉2,3

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3.国家农业科技华东(江苏)创新中心农产品加工工程技术研究中心，江苏 南京 210014)

以万寿菊干花颗粒为原料，对万寿菊花中反式叶黄素进行同时提取皂化工艺研究。考察不同有机溶剂和用量、KOH-乙醇溶液质量浓度和用量、提取皂化温度和时间等因素对反式叶黄素提取皂化效果的影响。在单因素试验基础上，采用响应曲面法对影响万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的3个主要因素即石油醚用量、KOH-乙醇溶液质量浓度和提取皂化温度进行优化，建立并分析各因素与反式叶黄素得率关系的数学模型，同时对反式叶黄素粗品进一步分离纯化。结果表明：采用有机溶剂法进行同时提取皂化的最佳工艺条件为石油醚用量42.6mL/g、温度58.8℃、KOH-乙醇溶液质量浓度0.099g/mL，在此条件下反式叶黄素得率为1.499%。对反式叶黄素粗品进一步纯化，最终获得纯度达90.42%的反式叶黄素晶体。

万寿菊；反式叶黄素；提取皂化；响应曲面法；纯化

叶黄素，是一种含氧类胡萝卜素，含有多个共轭双键，在理论上存在8种立体异构体，包括Z-和E-异构体(常称为顺式和反式异构体)，但由于叶黄素的甲基取代作用，只有9-Z、13-Z和15-Z异构体(和9＇-Z和13＇-Z)存在，叶黄素全反式的化学构象最为稳定，分子结构如图1，在生物体内反式构象的活性也较顺式构象高很多[1]。叶黄素是眼睛组织视网膜中的主要类胡萝卜素抗氧化成分，可预防老年性眼球视网膜黄斑退化引起的视力退化和失明症[2-3]。此外，叶黄素含有的共轭双键不仅赋予其颜色特征，也使其在疾病防治中具有较强的抗氧化功能，它们能阻止或预防癌症、抗诱变、动脉硬化、白内障等疾病[4-6]。

图1 全反式叶黄素分子结构Fig.1 Molecular structure of trans-lutein

万寿菊花中叶黄素含量高，其他类胡萝卜素杂质少，主要为叶黄素与月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸等饱和脂肪酸形成的酯，游离叶黄素含量很低。研究表明，叶黄素酯类衍生物不能被人体直接吸收代谢，必须先转化成游离叶黄素才能被人体吸收利用，因此对叶黄素酯类物质进行皂化，制备成游离叶黄素十分必要[7-9]。国内外生产叶黄素的方法大多采用提取、皂化、分离、纯化等步骤，其中，提取和皂化较为费时，若能将这两步同时进行，可以减少制备叶黄素酯这一复杂工艺，缩短制备时间。叶黄素传统的纯化方法是柱层析和重结晶，得到结晶叶黄素纯度很高，达95%以上，但柱层析需要消耗大量溶剂，费时费力不经济；而重结晶大多使用了含氯有机溶剂，应用受到限制[10-11]，故应寻找一种相对安全、经济的纯化方法。

国内外对万寿菊花中叶黄素的分析方法研究较多，主要采用AOAC法或HPLC分析，大都选用C18柱进行分离，只能分离检测出游离叶黄素。C30柱是继C18柱之后又一广泛应用的反相吸附色谱固定相，在分离类胡萝卜素几何异构体方面显示出优势，可以准确检测出反式叶黄素含量[12-14]。

在已有的报道中，对万寿菊叶黄素提取及皂化条件的优化多采用正交设计法[15-16]，侧重于科学地合理安排实验，减少实验次数，而在寻找因素和响应值之间的函数关系及各因素之间交互作用方面尚显不足。响应曲面法已被广泛应用于生物过程的优化，但在叶黄素提取皂化工艺研究方面仍是空白。因此本实验拟采用有机溶剂法进行反式叶黄素同时提取皂化工艺研究，通过响应曲面法优选最佳工艺参数，为进一步开发利用这一天然色素提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

万寿菊干花颗粒 云南曲靖博浩生物科技股份有限公司。

石油醚(沸程30～60℃)、THF(四氢呋喃)、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、无水乙醇、氢氧化钾(均为分析纯)；MTBE(甲基叔丁基醚)、甲醇(均为色谱纯)；反式叶黄素标准品(97%) 美国Fluka公司。

1.2 仪器与设备

HH-S恒温水浴锅 江苏金坛市恒丰仪器厂；TG16-WS台式高速离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；RE-52A真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；LGJ-12冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；FA2104电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；HPLC1200高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱分析条件

色谱柱为YMC Carotenoid S-5(4.6mm×250mm)，流动相：甲醇-MTBE=95:5(V/V)，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μL，检测波长450nm。

1.3.2 标准曲线的绘制

精确称取1mg反式叶黄素标准品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混匀，制成质量浓度40μg/mL的标准液。再分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准液置于10mL容量瓶中，混匀，制成2、4、6、8、10μg/mL反式叶黄素系列标准液。按照1.3.1节所述色谱条件分析，以反式叶黄素峰面积为纵坐标，反式叶黄素系列标准液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程Y=187.62X-97.07，R2=0.9992。

1.3.3 万寿菊花中反式叶黄素提取皂化工艺

将万寿菊干花颗粒粉碎过20目筛，准确称取万寿菊花粉1.00g，按照实验设计要求加入有机溶剂、KOH-乙醇溶液进行水浴加热回流提取皂化处理，提取结束后趁热过滤，残渣洗涤两次，合并滤液及洗涤液。将滤液真空浓缩至无馏出液，加入60mL 50%乙醇溶液，用醋酸水溶液调pH值至中性，离心去除上清液，沉淀物经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品。将反式叶黄素粗品用甲醇溶解稀释，用HPLC分析测定反式叶黄素含量，同时计算反式叶黄素得率。上述操作均在避光条件下进行。

1.3.4 单因素试验

本试验中主要考虑不同有机溶剂和用量、KOH-乙醇溶液质量浓度和用量、提取皂化温度和时间作为万寿菊花中反式叶黄素提取皂化过程的影响因素。在单因素试验中采用如1.3.3节所述的方法进行万寿菊花中反式叶黄素的提取皂化处理，用反式叶黄素得率评价试验效果。

1.3.4.1 有机溶剂对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

有机溶剂用量40mL/g、KOH-乙醇溶液质量浓度0.10g/mL、KOH-乙醇溶液用量15mL/g、提取皂化温度60℃、提取皂化时间3h，研究有机溶剂乙酸乙酯、丙酮、石油醚、正己烷和THF对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响。

1.3.4.2 有机溶剂用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

KOH-乙醇溶液质量浓度0.10g/mL、KOH-乙醇溶液用量15mL/g、提取皂化温度60℃，提取皂化时间3h，研究石油醚用量10、20、30、40、50mL/g时对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响。

1.3.4.3 KOH-乙醇溶液质量浓度对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

在石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液用量15mL/g、提取皂化温度60℃、提取皂化时间3h、研究KOH-乙醇溶液质量浓度为0.02、0.06、0.10、0.14、0.18g/mL时对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响。

1.3.4.4 KOH-乙醇溶液用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液质量浓度0.10g/mL、提取皂化温度60℃、提取皂化时间3h，研究KOH-乙醇溶液用量为5、10、15、20、25mL/g时对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响。

1.3.4.5 提取皂化温度对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液质量浓度0.10g/mL、KOH-乙醇溶液用量20mL/g、提取皂化时间3h，研究提取皂化温度40、50、60、70、80℃时对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响。

1.3.4.6 提取皂化时间对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液质量浓度0.10g/ mL、KOH-乙醇溶液用量20mL/g、提取皂化温度60℃，研究提取皂化时间为1、2、3、4、5h时对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响。

1.3.5 响应曲面法优选万寿菊花中反式叶黄素提取皂化工艺参数

表1 万寿菊花中反式叶黄素提取皂化试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction and saponification of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

根据单因素试验结果，用石油醚作为提取溶剂，确定提取皂化时间3h，KOH-乙醇溶液用量20mL/g，以石油醚用量(X1)、提取皂化温度(X2)和KOH-乙醇溶液质量浓度(X3)3个因素与反式叶黄素得率进行响应曲面试验设计(表1)，优化万寿菊花中反式叶黄素提取皂化工艺。通过Design Expert软件对试验数据进行回归分析，确定最佳工艺参数。

1.3.6 叶黄素粗品的进一步纯化

将1.3.3节中得到的反式叶黄素粗品用乙酸乙酯溶解，并用去离子水冲洗去除多余的皂化物质和水溶性杂质，将乙酸乙酯相减压浓缩，回收溶剂。向浓缩物中加入4倍体积的正己烷-丙酮混合溶剂(体积比为4:1)，并在室温下静置30min后过滤，再分别用少量0～5℃无水乙醇和去离子水洗涤，经真空冷冻干燥制得反式叶黄素晶体。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同有机溶剂对万寿菊花中叶黄素提取皂化效果的影响

图2 不同有机溶剂对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响Fig.2 Effect of organic solvent type on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

由图2可见，用石油醚作为提取溶剂，反式叶黄素得率最高，为1.467%，乙酸乙酯得率最低，为0.255%。原因可能是由于石油醚极性较低，对叶黄素脂肪酸酯的溶解性最大，使得皂化反应比较充分。THF对游离态的叶黄素溶解性最大，目前许多人应用THF提取叶黄素，然而有研究表明THF容易形成过氧化物，可能会导致叶黄素的分解[17]。因此，对万寿菊干花颗粒中反式叶黄素的提取可选用石油醚，而且石油醚在后续分离提纯工序中易于除去。

2.1.2 有机溶剂用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

液固比是提取过程的一个重要影响因素，液固比的大小会影响两相的混合情况。尤其在搅拌不充分的情况下，会改变表观传质系数，从而影响传质速率[18]。液固比的提高必然会在较大程度上提高传质推动力，但也提高了生产成本及后续处理的难度，所以液固比不宜过高。由图3可知，选择有机溶剂石油醚用量40mL/g比较合适。

图3 石油醚用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响Fig.3 Effect of petroleum ether amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

2.1.3KOH-乙醇溶液质量浓度对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

图4 KOH-乙醇溶液质量浓度对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响Fig.4 Effect of KOH-ethanol concentration on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

由图4可见，KOH-乙醇溶液质量浓度在0.02～0.18g/ mL范围内，随着KOH质量浓度的增加，皂化产品中反式叶黄素得率逐渐升高，高于0.10g/mL则有下降趋势。可能是由于反式叶黄素在强碱环境会分解，使得其得率降低，因此选用0.10g/mL的KOH-乙醇溶液为皂化液。

2.1.4KOH-乙醇溶液用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

由图5可见，KOH-乙醇溶液用量在5～25mL/g范围内，随着KOH-乙醇溶液用量的增加，皂化产品中反式叶黄素得率逐渐升高，高于20mL/g则有下降趋势。主要是由于KOH-乙醇溶液体积增大，导致强碱性环境中游离的反式叶黄素易于发生分解，而且在提取皂化处理过程中需要耗费大量的酸中和、去离子水洗涤，从而也造成反式叶黄素的损失，因此选择KOH-乙醇溶液用量为20mL/g。

图5 KOH-乙醇溶液用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响Fig.5 Effect of KOH-ethanol amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

2.1.5 提取皂化温度对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响

图6 温度对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

由图6可见，提取皂化温度在40～80℃范围内，皂化产品中反式叶黄素得率呈先上升，随后下降的趋势。由于温度过低，不利于提取出来的叶黄素酯在皂化体系中分散，易导致皂化不完全，而温度过高则会导致游离反式叶黄素的降解和异构化，导致产品中反式叶黄素得率下降。因此，提取皂化温度控制在60℃为宜。

图7 提取皂化时间对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响Fig.7 Effect of extraction time on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

2.1.6 提取皂化时间对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果的影响由图7可见，当提取皂化时间小于3h时，随着提取皂化时间的延长，皂化产品中反式叶黄素得率呈逐渐增大的趋势。当提取皂化时间超过3h时，反式叶黄素得率有所下降。这是因为随着时间的延长，反式叶黄素在碱性条件下易发生氧化和异构化，故提取皂化时间以3h为宜。

2.2 响应曲面法优化万寿菊花中反式叶黄素提取皂化工艺

表2 万寿菊花中反式叶黄素提取皂化试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of response surface experiments for optimizing the extraction and saponification of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

在单因素试验基础上，对石油醚用量(X1)、提取皂化温度(X2)和KOH-乙醇溶液质量浓度(X3)进行了三因素三水平响应曲面试验设计，试验设计与结果见表2。利用Design Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到反式叶黄素得率预测值(y)对编码自变量x1、x2和x3的二次多元回归方程：

对上述回归模型进行方差分析(表3)，结果表明，模型极显著(P＜0.0001)，失拟检验不显著，回归模型的调整确定系数为0.9568，说明该模型能够解释95.68%的变化，因此，可用此模型对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果进行分析和预测。

从表4回归方程系数显著性检验可知：模型(1)一次项x1、x2、x3均处于显著水平；二次项x32极显著，x12、x22显著；交互项x1x3显著，x1x2、x2x3均不显著。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 回归方程系数显著性检验表Table 4 Significance test for regression coefficients

利用Design Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图8～10。

图8 提取皂化温度和石油醚用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果影响的响应曲面和等高线Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and petroleum ether amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

当KOH-乙醇溶液质量浓度为0.10g/mL时，提取皂化温度和石油醚用量对万寿菊花中反式叶黄素提取效果影响见图8。石油醚用量不变时，提取皂化温度在55～65℃范围内，反式叶黄素得率随着温度的增加而增加，当提取皂化温度达到一定值后，反式叶黄素得率逐渐下降。提取皂化温度一定时，石油醚用量在35～45mL/g范围内，反式叶黄素得率先逐渐增加，达到极大值后逐渐下降。

图9 KOH-乙醇溶液质量浓度和石油醚用量对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化效果影响的响应曲面和等高线Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between KOH-ethanol concentration and petroleum ether amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

当提取皂化温度为60℃时，KOH-乙醇溶液质量浓度和石油醚用量对万寿菊花中反式叶黄素提取效果的影响见图9。石油醚用量不变，KOH-乙醇溶液质量浓度在0.05～0.15g/mL范围内，反式叶黄素得率随着KOH-乙醇溶液质量浓度的增加而增加，当KOH-乙醇溶液质量浓度达到一定值后，反式叶黄素得率呈逐渐下降的趋势。KOH-乙醇溶液质量浓度一定时，石油醚用量在35～45mL/g范围内，反式叶黄素得率先逐渐增加，达到极大值，随后逐渐下降。

当石油醚用量40mL/g，KOH-乙醇溶液质量浓度和提取皂化温度对万寿菊花中反式叶黄素提取效果的影响见图10。当提取皂化温度不变时，KOH-乙醇溶液质量浓度在0.05～0.15g/mL范围内，随着KOH-乙醇溶液质量浓度的增加，反式叶黄素得率增加，当KOH-乙醇溶液质量浓度达到一定值后，得率逐渐下降。KOH-乙醇溶液质量浓度恒定，在温度55～65℃范围内，随着温度的升高，反式叶黄素得率增加，但超过一定值后温度的升高对反式叶黄素得率的影响却发展为负面效应。

图10 KOH-乙醇溶液质量浓度和提取皂化温度对万寿菊花中叶黄素提取皂化效果影响的响应曲面和等高线Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between KOH-ethanol concentration and extraction temperature on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

为了进一步确定最佳点，对模型(1)取一阶偏导等于零并整理得：

求解方程得到最佳工艺参数石油醚用量42.6mL/g、温度58.8℃、KOH-乙醇溶液质量浓度0.099g/mL，在此条件下，反式叶黄素得率可达1.494%。按优化工艺进行3次重复实验，反式叶黄素的得率为(1.499±0.008)%，与传统工艺(正己烷萃取、KOH-乙醇溶液皂化、水洗涤后离心分离得到叶黄素粗品，反式叶黄素得率1.352%)相比，得率提高了10.87%，另外同时提取皂化简化工艺，溶剂消耗量小，且整个反应过程只需3h，可应用于实际生产过程中。

2.3 反式叶黄素粗品的纯化

图11 反式叶黄素晶体HPLC色谱图Fig.11 HPLC chromatogram of trans-lutein crystal

反式叶黄素粗品经乙酸乙酯分离后，先用去离子水洗涤去除水溶性杂质，然后用正己烷-丙酮复合溶剂洗涤去除脂溶性杂质，最后用冷乙醇和水洗涤可以除去大部分的有机溶剂，并使叶黄素的损失降到最低，经纯化后，得到反式叶黄素晶体，纯度达到90.42%，与传统纯化方法获得的叶黄素晶体纯度相当。反式叶黄素晶体HPLC色谱图如图11所示，与反式叶黄素标品出峰时间一致，经光电二极管阵列检测器(DAD)检测分析，其相似度达到98.9%。

3 结 论

本研究将万寿菊花中反式叶黄素的提取与皂化过程同时进行，简化了传统叶黄素的制备工艺。由于提取与皂化过程的同时进行，使得万寿菊花中叶黄素酯充分溶出，从而提高反应效率，缩短了制备时间，避免了游离叶黄素长时间接触空气而氧化和异构化。

应用响应曲面法对万寿菊花中反式叶黄素的提取皂化工艺进行了探讨，对万寿菊花中反式叶黄素提取皂化工艺条件中有机溶剂用量、KOH-乙醇溶液质量浓度、提取皂化温度的最优化组合问题进行了定量研究，建立了具有良好预测性能的万寿菊叶黄素提取皂化条件的模型，并获得最佳工艺条件为石油醚用量42.6mL/g、温度58.8℃、KOH-乙醇溶液质量浓度0.099g/mL时，反式叶黄素得率为(1.499±0.008)%。

反式叶黄素粗品经纯化后，最终获得高纯度的反式叶黄素晶体纯度达90%以上，生物活性高，没有使用传统的纯化方式如凝胶柱层析或重结晶，得到产品相对安全、经济，可应用于医药、保健食品领域。

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Extraction and Saponification of Trans-lutein from Marigold Flowers

WANG Chuang1，LI Da-jing1,2,3,*，SONG Jiang-feng2,3，LIU Chun-quan2,3
(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Institute of Farm Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；3. Engineering Research Center for Agricultural Products Processing, National Agricultural Science and Technology Innovation Center in East China, Nanjing 210014, China)

Marigold (Tagetes erecta) flowers were used as raw materials to investigate the extraction and saponification of translutenin from marigold flowers. The effects of organic solvent amount, KOH-ethanol concentration and amount, extraction and saponification temperature and time on extraction and saponification rate of trans-lutenin from marigold flowers was explored. Based on the single factor experimental results, response surface experiments were used to optimize the extraction and saponification efficiency of trans-lutein and a mathematic model between the factors and extraction rate of trans-lutenin from marigold flowers was established. Meanwhile, crude trans-lutein was further purified. Results indicated that the optimal extraction parameters were raw material amount of 1.00 g, petroleum ether amount of 42.6 mL/g, KOH-ethanol concentration of 0.099 g/mL and extraction temperature of 58.8 ℃. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of trans-lutein was up to 1.499%. After the purification of trans-lutein, the content of trans-lutein crystal was up to 90.42%.

Tagetes erecta；trans-lutein；extraction and saponification；response surface methodology；purification

TS202.3

A

1002-6630(2010)24-0095-07

2010-03-01

江苏省自然科学基金项目(BK2010467)；中央高校基本科研业务费专项(DL10BA12)

王闯(1985—)，女，硕士研究生，主要从事天然产物研究。E-mail：wangchuang0406@126.com

*通信作者：李大婧(1976—)，女，副研究员，博士，主要从事天然产物研究。E-mail：lidajing@163.com