不同持续时间有氧运动对动脉粥样硬化大鼠血管内皮依赖性舒张功能的影响

周 亮 申伟华 唐 晖

（湖南科技大学体育学院，湖南湘潭411201）

动脉粥样硬化 （atherosclerosis，AS）是危害人类健康的一种常见老年疾病。研究表明，有氧运动是改善心血管健康，预防和辅助治疗动脉粥样硬化的有效手段。已知运动改善心血管健康与促进血管内皮细胞的NO释放、改善血管内皮依赖性舒张功能有关，但是不明确何种强度和多长时间的运动为最适宜刺激。血管内皮依赖性舒张功能主要受NO和ET两种信号分子的调节，NO为内皮细胞释放的舒张血管物质，而ET是已知的最为有效的收缩血管的物质。内皮细胞的NO释放受一些因素的调节，其中NOS是NO合成的关键限速酶，L-Arg可以有效促进NO释放，但是L-Arg的竞争抑制物ADMA却抑制内皮的NO释放。关于不同运动持续时间对血管内皮依赖性舒张功能的影响鲜见报道，本研究试图探索不同运动时间对内皮NO释放量和一些调节内皮NO释放的因素的影响，为运动抗动脉粥样硬化提供实验支持并探索合适的运动时间。

1 实验对象和方法

1.1 实验对象

雄性SD大鼠60只，9周龄，体重250±10g，为II级实验动物，购于中南大学医学部实验动物学部。室温20～24℃，自然光照，自由饮食、饮水，每笼5只饲养1周后用于实验。

1.2 动物模型的建立

依照参考文献，给予AS、ASL、ASM和ASH组高脂饲料，高脂饲料配方:大鼠标准饲料中加1%胆固醇，0.35%胆酸钠，5%猪油，0.61%丙基硫氧嘧啶。前三天按70万IU/kg的总剂量分三次灌胃给予维生素D3。动物建模时间为6周，6周后进行动物模型检验。

1.3 动物分组

于动物模型建立实验前，随机选取10只为对照组，未进行动物建模。建模成功大鼠随机分为五组，C组 （正常对照组）、AS组 （动脉粥样硬化模型组）、ASS组 （动脉粥样硬化+30 min有氧运动）、ASM组 （动脉粥样硬化+60 min有氧运动）、ASL（动脉粥样硬化+90 min有氧运动），每组各10只。

1.4 有氧训练安排

以上动物分组后进行三天的跑台训练，然后进行正式运动实验。根据参考文献和本实验室的前期成果，大鼠跑台运动强度跑速为20 m/min。三个运动组的运动时间分别设计为30 min、60 min、和90 min。实验持续时间为4周，每周训练6天，每天一次训练。

1.5 测试方法

1.5.1 动物模型检验

动物模型建立为6周时间，建模后每组取3只处死，提取主动脉环，主动脉切片常规HE染色，光镜下观察检验模型建立是否成功。

1.5.2 动物取材

训练结束后即刻用戊巴比妥钠腹腔麻醉、宰杀，腹主动脉取血。血液提取后静置30 min，3000转离心10 min，分离血清，-80超低温冰箱保存，供实验分析。

1.5.3 NO和NOS测定

NO和NOS的测定均采用购自南京建成生物研究所的试剂盒测定，NO测定采用硝酸还原酶法，NOS测定采用比色法，实验过程严格按试剂盒说明进行。

1.5.4 ET的测定

放免法。试剂盒购自北京北方生物技术研究所，实验过程严格按试剂盒说明进行。

1.5.5 血浆ADMA和L-Arg测定

根据文献，处理样品。按1 ml血清加入20 mg的5-磺基水杨酸 （salicylsulfonic acid，SSA）沉淀蛋白，冰浴反应10 min，离心 （2 000g，10 min），吸取上清，0.45μ m的滤膜过滤后待测。L-Arg和ADMA标准品用50%甲醇配成100 mg/mL左右浓度的储备液，-20℃储存。临用前用人工脑脊液（NaCl 7.605 g，KCl 0.223g，NaH2PO4◦2H2O 0.072 g，NaHPO4◦12H2O 0.014 g，NaHCO32.1 g，MgCl2◦6H2O 0.162 g，CaCl20.144 g，溶解后定容至1 000 mL，pH=7.4）稀释后测定，稀释倍数分别为80倍，200倍，400倍，800倍和1 600倍。将27 mg邻苯二甲醛 （OPA）溶于0.5 mL甲醇中，再加入 2-巯基乙醇 （2-MCE）20μ L，加入0.1 mmol/L四硼酸钠缓冲液 （pH=9.5）至5 mL制得衍生液，避光室温保存。上样前将20μ L标准液或样品液与10μ L衍生液混匀，精确反应90 s，进样20μ L。流动相包括四种，各自成分如下:流动相A:100%甲醇，流动相B:纯水，流动相C:25%甲醇，3%四氢呋喃，72%0.05M PBS，流动相D:70%甲醇，3%四氢呋喃，27%0.05M PBS，流动相均经0.45μ m滤膜过滤，超声波脱气后使用。采用Waters HPLC系统，分析柱为Inertsil ODS-2，流速为1 mL/min，温度为30℃，荧光检测调节为激发光338 nm、发射光425nm。

根据标准品作出标准曲线，计算出函数，将所测样品的峰面积分别代入函数，计算 L-Arg及ADMA水平。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 动物模型检验

对照组动脉各层结构完整，无钙化及脂肪沉淀。各造模组大鼠主动脉切片可见内膜细胞增生及内皮下出现淡染的空泡等动脉粥样硬化的早期病变，有些部位可见中膜平滑肌细胞增生、排列紊乱或隆起呈斑块状结构，有些部位中膜有明显的钙化形成，说明造模成功。

2.2 血清NO、NOS和ET浓度变化

实验结果发现，动脉粥样硬化各组的血清NO浓度无论在有氧训练前和运动训练安排的各时段均明显低于对照组，其差异均具有统计学显著意义。无论运动时间的长短，均可明显改善血管内皮的NO释放量，数据显示各运动组的NO值均明显高于安静对照组和AS模型组。动脉粥样硬化发展过程中，NOS的活力降低，AS模型组的NOS活性明显低于安静对照组，而有氧练习，不论时间长短，均可改善NOS的活性，各运动组NOS活性明显提高，与模型组比较有显著意义。ET水平在动脉粥样硬化发展过程中明显升高，有氧练习显著的降低血清的 ET水平。（见表1）

表1 血清NO、NOS和ET浓度变化 ，n=15）

表1 血清NO、NOS和ET浓度变化 ，n=15）

注:1）与对照组相比较P＜0.05; 2）与AS组比较P＜0.05

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2.3 血清ADMA、L-Arg浓度及ADMA/L-Arg比值变化

实验结果发现，L-Arg的水平各组都没有明显变化，动脉粥样硬化模型组的L-Arg和安静对照组及各运动组比较逗没有显著差异。而血清ADMA水平在动脉粥样硬化发病过程中有明显上升，模型组和对照组相比有显著差异。短时间的有氧练习 （30 min）对血清ADMA的影响不大，ASS组和模型组相比较没有显著差异，而较长时间的有氧练习明显降低血清ADMA水平，ASM组和ASL组与模型组相比较都有显著差异。实验结果还显示，动脉粥样硬化发病过程中 L-Arg/ADMA比值明显降低，不同时间的有氧练习均可以提高这一比值。

表2 血清ADMA、L-Arg浓度及ADMA/L-Arg比值变化 （，n=15）

表2 血清ADMA、L-Arg浓度及ADMA/L-Arg比值变化 （，n=15）

注:1）与对照组比较P＜0.05;2）与AS及ASL组比较P＜0.05

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3 讨论

大量实验证实，规则、周期性、中小运动强度的有氧运动可以预防动脉硬化，改善心血管健康。Maiorana A教授认为，运动改善心血管健康主要通过NO途径实现，当前关于运动诱导NO释放改善心血管健康的关键问题是:何种强度以及多长时间的运动更为有利。在动物实验中，动物运动量和运动强度的把握，成为能否得到合理的实验结果的制约因素。本实验采用递增运动负荷，靶强度为20 m/min，一次运动时间60 min的运动方案，根据加拿大学者Fernando研究的推断，应为中等强度有氧运动。经本实验室前期研究表明，这一强度的有氧练习可以有效改善动脉粥样硬化的大鼠的血清NO释放量。

动脉粥样硬化 （athemsclerosis，AS）是严重危害人类健康的常见疾病之一，它是由内皮细胞功能受损导致血管扩张和收缩功能障碍引起的。ET是内皮细胞分泌的一种最强的缩血管活性多肽，NO是一种很强的舒血管物质。正常情况下，内皮细胞所分泌的ET、NO应该处于一种平衡状态，AS的内皮细胞功能异常主要表现为ET、NO的失衡。对于运动时内皮细胞功能改变的AS，有学者研究指出:NO是一种体内氧自由基清除剂，NO生成越少，则过氧化物生成越多，可促进AS的形成。本研究显示，大鼠在动脉粥样硬化发展过程中，血清NO量明显降低，血清ET含量明显上升，这和大部分的报道一致。不同实验发现，不同时间的有氧练习均有利于增加血清的NO释放量，提示各种强度的有氧练习均有利于改善心血管健康。但是不同时间的有氧练习对ET释放的影响不一，长时间练习的效果明显优于短时间的练习。

一氧化氮的生成主要通过NOS，利用L-Arg为底物合成。NO的生成依赖于NOS的活性和LArg的可利用度。一些学者假设给予L-Arg可能具有治疗作用。，Adams等进行的一项以经血管造影证实的冠心病患者为研究对象的实验中，10名患者随机分为2组.L-Arg组给予口服 L-Arg，连用3天，对照组给予安慰剂口服，结果显示内皮依赖性肱动脉舒张功能在L-Arg组得以改善。本实验发现，在动脉粥样硬化发展过程中，NOS活性降低，各运动组均可明显提高血清NOS活性，与模型组相比有显著意义的差异。

内源性NOS抑制物为L-精氨酸的同系物，其中研究较多的是不对称二甲基精氨酸 （ADMA），其竞争性抑制NOS活性，使NO的抗动脉硬化作用减弱，导致动脉硬化的发生、发展。自ADMA第一次被认为是一氧化氮 （NO）途径内源性抑制剂以来，它在调节NO产生中所起的作用越来越受到重视。在动脉中输人ADMA能够引起血管收缩。当前的实验和l临床数据表明ADMA浓度的轻微改变能显著影响血管NO的产生，血管紧张度和全身血管抵抗。这表明ADMA可以作为一个内皮细胞功能紊乱的标记。因此，L-Arg/ADMA比值被认为是评价动脉粥样硬化风险的重要指标。本研究发现，动脉粥样硬化发展过程中，血清L-Arg值变化很小。但是，本实验也发现动脉粥样硬化模型组的血清ADMA值明显升高，而L-Arg/ADMA比值下降。实验结果表明，运动不会影响L-Arg水平，但是会降低 ADMA水平，从而改善 LArg/ADMA比值。

4 结论

4.1 实验结果显示，无论多长时间的有氧运动均可以显著提高血清NO水平并明显提高血清NOS的含量;不同时间的有氧练习均降低血清ET水平，但是较长时间的运动效果更为明显。

4.2 动脉粥样硬化发展过程中L-Arg浓度变化并不明显，但是ADMA水平明显上升。各种不同时间的有氧练习也不会改变血清L-Arg水平，但是较长时间的有氧练习有利于降低血清ADMA水平，因此可以有效改善L-Arg/ADMA比值。

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