猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌毒素基因的原核表达

江 涛,谭春萍,任灵芝,黄百花,刘文娟,陆芹章*

(1.广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;2.固始县动物疫病预防控制中心,河南固始465200)

产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxingenic Pasteurella multocida,T+Pm)是猪进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要病原之一[1-2]。该菌与支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)感染猪后损害其呼吸道,使机体抵抗力下降,并可继发感染支原体、嗜血杆菌、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒,增加了猪的病死率[3]。多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)为PAR的主要致病因子[4-6],由T+Pm toxA基因编码的大小为146 ku的蛋白,是重要保护性抗原之一[7],也是鉴别T+Pm与非产毒素巴氏杆菌(Non-toxingenic Pasteurella multocida,T—PM)的主要对象,因而研究PMT对该病的临床诊断及防控有重要意义。

目前对于PAR的防控主要是使用抗生素类药物,但抗生素的使用导致耐药菌株的产生及其残留,严重威胁到公众的健康,因此研制PAR疫苗倍受关注[8-9]。天然毒素作为PAR的重要保护性抗原,但其分泌量低,不到菌体蛋白的0.6%,且蛋白的纯化复杂,纯类毒素与粗类毒素对机体的免疫效果存在差异。因此,本研究通过对该毒素基因的克隆表达及其免疫学特性的研究,可为临床疫苗研制提供足量的高纯度抗原及该毒素检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒、试剂及培养基 猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌由广西大学动物科学技术学院预防兽医实验室分离鉴定;大肠埃希菌DH5α、BL21(DE3)、PET-32a(+)表达载体购自Novagen公司;PMD-18T克隆载体、酶、dNTPs、IPTG、Bam HⅠ及SalⅠ为宝生物工程(大连)有限公司产品;辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG、氨苄青霉素为Sigma公司产品;胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品;Ni-NTA蛋白纯化树脂购自QIAGEN公司产品;LB(Luria Bertani)培养基和LA培养基(LB+15 g/L琼脂),筛选培养基为含100 μ g/mL氨苄的LA培养基,均由本室自制。1.1.2 实验动物 16 g～20 g昆明小鼠,购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计 根据GenBank上公布的toxA序列AF240778及参考文献[1]设计一对引物:toxA-F:5′-TAGGATCCATGAAAACAAAACATT TT T T-3′;toxA-R:5′-GCGTCGACT TATAGTGCTCT TGT TAAGC-3′

分别在toxA-F及toxA-R的5′端加入BamHⅠ及SalⅠ酶切位点如划线部分所示,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 toxA基因的克隆和表达载体的构建 将分离鉴定的产毒素多杀性巴氏杆菌[10]扩大培养后,按文献[11]中的方法将菌体洗涤反复冻融后作为toxA基因扩增模板。采用25 μ L的PCR反应体系:10×Taq buffer 2.5 μ L,20 mmol/L MgCl2 2.5 μ L,2 μ mol/L dNTPs 0.5 μ L,20 μ mol/L上下游引物各0.5 μ L,Taq DNA polymerase 0.5 μ L,无菌水15 μ L,模板3 μ L。PCR扩增反应条件为:94℃变性5 min;94℃,30 s,50℃,30 s,72℃3.5 min,35个循环;72℃延伸10 min。用DNA回收试剂盒回收PCR产物,与pMD-18T连接后转化大肠埃希菌DH5α,获得重组质粒PMD-toxA。经测序和用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定后,回收3 858 bp的toxA片段。将回收的toxA片段和经相同酶酶切后的pET-32a用T4 DNA连接酶连接,转化大肠埃希菌DH5α。将筛选阳性克隆扩大培养后,提取重组质粒PET-toxA,用BamHⅠ和SalⅠ酶切鉴定。

1.2.3 toxA基因原核表达载体的诱导表达和表达产物的提取 将重组表达质粒PET-toxA转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单个菌落,于37℃培养至OD630值达到0.6～0.8,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续培养6 h,收集菌体。按常规方法提取包涵体,进行80 g/L分离胶的SDS-PAGE分析。

1.2.4 重组蛋白的纯化及Westen blot检测 按《分子克隆实验指南(第3版)》所述方法对表达产物toxA进行Western blot分析。用猪萎缩性鼻炎疫苗(含毒素)免疫的猪阳性血清作为一抗,二抗为HRP标记的羊抗猪IgG。

1.2.5 表达产物的小鼠攻毒试验 利用Ni-NTA树脂对1.2.3中处理包涵体蛋白进行纯化,并将纯化后的重组蛋白复性,无菌PBS透析,滤膜过滤后备用。将30只昆明鼠分为6组,5只/组,其中Ⅰ～Ⅳ组按参考文献[12]的攻毒剂量,用表达产物进行腹腔注射攻毒,0.2 mL/只,Ⅴ组用抽提的天然毒素[10]进行攻毒,Ⅵ注射无菌PBS作为阴性对照。观察小鼠在72 h内的临床表现及其剖检变化。

1.2.6 表达产物免疫原性检测 将上述攻毒后存活且精神状态恢复小鼠分别在攻毒后的第15天、28天以相同剂量的表达蛋白进行腹腔注射免疫接种,在第40天采血,分离血清于—20℃保存备用。将表达产物及天然毒素蛋白以1 μ g/点点样于硝酸纤维素膜上,置37℃吸附30 min后,于4℃封闭过夜,用PBST洗3遍后加入1∶200稀释的上述小鼠阳性血清及空白血清,并按Westen blot步骤进行操作,观察表达产物免疫后血清反应原性。

1.2.7 表达产物对免疫血清的检测 按照参考文献[13]方法稍加改进提纯天然毒素,利用方阵滴定的方法确定天然毒素与表达重组蛋白的最佳包被浓度与阳性血清的最佳稀释度,两种抗原按最佳浓度包被后,按间接ELISA的常规操作方法,对10份阳性血清(琼扩效价达到1∶16～1∶32)及阴性血清进行检测。每份血清重复3次,求其OD450平均值作为试验结果,对比天然毒素与重组蛋白的差别。

2 结果

2.1 toxA基因的克隆和表达载体的构建

PCR扩增toxA片段约为3 858 bp与预期结果相符(图1)。将目的片段插入到pET-32a的BamHⅠ和SalⅠ位点,得到重组表达质粒PET-toxA,其双酶切鉴定结果如图2所示,片段大小分别为3 858 bp和5 900 bp。

2.2 toxA基因的表达

将构建的质粒PET-toxA转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在175 ku处有明显的表达条带。表达产物SDS-PAGE电泳后转膜进行Westen blot,结果表明,在175 ku左右出现特异性反应条带,对照菌未出现明显条带(图3)。

2.3 动物试验

试验小鼠攻毒后,Ⅰ组～Ⅳ组(攻毒用剂量分别为0.75、1.5、3、10 μ g)72 h内未出现死亡,但攻毒小鼠均表现为精神沉郁,活动量减少,第Ⅳ组表现最为严重,第Ⅰ组相对较轻;Ⅴ组在攻毒后的72 h内全部死亡;Ⅵ组无任何临床表现,第Ⅴ组剖检见内脏有小点出血,肝、脾表面有半透明的假膜。剖检存活小鼠发现:第Ⅵ组无可见病变;第Ⅰ组～Ⅳ组,肝、肾、心外膜及内膜均有出血点,脾脏较第Ⅵ组小,但无假膜出现。

2.4 表达产物的免疫原性

待攻毒小鼠恢愎正常精神状态后,对第Ⅳ组小鼠两次用10 μ g表达产物进行腹腔注射,取血清进行Dot-ELISA鉴定,结果表明该阳性血清均与天然毒素蛋白及表达重组蛋白反应,对照血清无可见反应(图4)。

图1 PCR扩增毒素基因Fig.1 Amplified the gene of Pasteurella multicoda toxA by PCR

图2 重组质粒(PET-toxA)的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant PET-toxA plasmid by digestion

图3 重组质粒PET-toxA的表达产物的Westen blot(A)及SDS-PAGE(B)结果Fig.3 Westenen blot(A)and SDS-PAGE(B)results of PET-toxA ex pression products

图4 重组蛋白的免疫原性鉴定Fig.4 The identification of antigenicity of recombinant protein

2.5 表达产物对免疫血清的检测

根据棋盘滴定的结果,天然毒素与表达蛋白的最佳包被浓度为1.25 μ g/mL和0.6 μ g/mL,血清的最佳稀释度为1∶200。在血清检测结果(表1)中,天然毒素抗原检测OD450值显著高于重组蛋白,P/N值二者无明显差异;阴性血清检测OD450值也高于表达蛋白,说明表达蛋白非特异性较高。

表1 表达产物对免疫血清的检测结果Table 1 The results of detect to antiserum against native PMD using expression products

3 讨论

PMT是PAR的重要的保护性抗原,以PMT制作的疫苗能够产生特异性的保护。因此PMT疫苗的研究对实际生产有着重要的意义。但由于菌体免疫效果不理想,天然毒素在菌体的含量较低,大量提纯的难度及费用较高,因此用天然PMT生产疫苗是不现实的。为解决上述难题,人们通过对PMT亚单位疫苗及核酸疫苗的研究取得了一定的成果,因此,这两种疫苗的研究在AR的防控中是极具前景的疫苗。

本研究成功地扩增出猪源D型产毒素多杀性巴氏杆毒素toxA基因,并对其进行表达。攻毒试验结果表明,表达重组蛋白具有一定的生物学活性,能够引起小鼠的病变,但无天然蛋白活性强。可能是表达蛋白的构象并未达到天然蛋白那样完美使其毒性存在差别,或者是表达蛋白本身所带载体部分的蛋白抑制其生物学特性,这还需要进一步的探讨验证。Western blot分析及重组蛋白免疫小鼠动物试验表明,重组蛋白具有免疫原性及反应原性,为临床应用疫苗的研制及利用抗原抗体结合方法检测毒素奠定了基础。Asuka T I等[14]利用DEAE亲和层析方法纯化重组蛋白,检测疫苗免疫血清已取得了较好的检测效果。本研究的检测结果表明,重组蛋白的OD450值较低,可能是因为表达蛋白与天然蛋白的空间构象差异所致,但其作为检测用抗原非特异性反应弱。表达蛋白能否用于临床检测血清中的抗体,仍需对其表达的条件进行进一步的试验研究。

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