青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞系HFL-I细胞胶原合成的影响及机制

王昌明,张孝飞＊,吕 倩,黄岚珍,范才文

(1桂林医学院附属医院,广西桂林 541001;2桂林医学院科学实验中心)

肺纤维化是多种病因引起的一种慢性炎性间质性肺部病变,多数患者在发病 3～8 a后死亡,目前尚无有效治疗方法。肺成纤维细胞的过度增生和胶原分泌在肺纤维化形成过程中扮演重要角色。近年研究发现,青蒿素类药物除治疗疟疾外,亦具有抗肿瘤及抗纤维化等作用[1,2]。我们前期研究了青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(HELF)系HFL-I细胞增殖、凋亡的影响及机制[3]。2009年 6～9月,我们观察了青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞胶原合成的影响,旨在进一步探讨其对肺纤维化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HFL-I细胞株(中科院细胞库),青蒿琥酯(纯度 ＞99%,广西桂林南药公司),碘化丙啶(PI,上海浩然生物技术有限公司),CCK-8、0.1%天狼腥红苦味酸染液、胰酶(Sigma公司),D-MEM/F-12培养基,胎牛血清。RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司),反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit及PCR试剂盒Prem ix PrimeSTAR HS,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养 用含体积分数10%的胎牛血清、1 ×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的D-MEM/F-12培养液培养细胞,于 37℃、5%CO2培养箱培养, 3 d换液 1次,每 5～6 d传代 1次;传 4代以上用于下列实验。

1.3 青蒿琥酯处理及HFL-I细胞胶原检测 取对数生长期HFL-I细胞,用D-MEM/F-12培养液调整细胞浓度为 1×105/m l,接种至 96孔培养板,每孔200μl,37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,24 h后随机分为观察 1～3组及对照组,前三组分别加入质量浓度为1、10、100 mg/L的青蒿琥酯,对照组加等体积的培养液,每组设 4个复孔。分别培养 48 h后吸去培养液,每孔加甲醇100μl,-20℃固定过夜,PBS洗1次,天狼猩红室染1 h,0.1%醋酸洗3次,每孔加入0.1μmol/L氢氧化钠20μl,室温振荡1 h,于倒置显微下摄像,于酶标仪 540 nm处检测各孔吸光度A值,实验重复3次取其均数。

1.4 青蒿琥酯处理及Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白 mRNA表达测定 HFL-I细胞种于6 cm板,细胞贴壁并长至80%峰度后同上分组及处理,继续培养48 h后,用Trizol试剂提取高质量的mRNA。按照反转录试剂盒说明合成cDNA。Ⅰ型、Ⅲ型前胶原及内参β-actin扩增产物长度分别为159、447、300 bp。PCR反应条件：预变性：94℃3min,变性：94℃30 s,退火：61～65℃30 s,延伸：72℃45 s,循环扩增：30个循环。半定量RT-PCR法测定Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA水平,以目的基因/内参β-actin值表示, PCR实验重复 3次。

1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件。计量资料以±s表示,采用方差分析及t检验,P≤0.05为差异有显著性。

2 结果

各组HFL-I细胞胶原、Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达结果见表1。由表1可见,HFL-I细胞胶原、Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达均呈剂量依赖性关系,随着青蒿琥酯浓度的增加,三指标表达均呈降低趋势。

表1 各组HFL-I细胞胶原、Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达(±s)

表1 各组HFL-I细胞胶原、Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达(±s)

注：与对照组比较,＊P＜0.05,△P均＜0.01;与观察 2组比较, #P＜0.05;与观察 1组比较,○P＜0.05

组别 HFL-I细胞胶原(A值)Ⅰ型前胶原蛋白mRNAⅢ型前胶原蛋白mRNA观察1组 0.608±0.040＊#0.565±0.030△#0.123±0.010△#观察2组 0.589±0.020＊ 0.448±0.020△ 0.070±0.010△观察3组 0.412±0.050△#○0.188±0.030△#○0.031±0.000△#○对照组 0.619±0.050 0.882±0.040 0.295±0.020

3 讨论

肺纤维化是多种肺疾病发展到晚期的共同病理变化。其集中表现为成纤维细胞异常增殖和细胞外基质的过度沉积,在肺部,细胞外基质的主要成分之一胶原即来自于活化的成纤维细胞。由于纤维细胞的异常增殖及胶原的过度分泌在肺纤维化过程中起重要作用[4],故抑制胶原过度分泌是防治肺纤维化的有效手段。

前胶原是成熟胶原的前体分子,其水平可反映胶原的生物合成活性。侯杰等[5]报道,Ⅰ、Ⅲ型胶原合成与降解失衡在肺纤维化发生、发展过程中起主要作用,在肺泡炎阶段或肺纤维化早期主要以Ⅲ型胶原增加为主,此期病变尚可逆转,随后病变转为慢性,则以Ⅰ型胶原沉积为主,形成不可逆转的改变。本研究显示,青蒿琥酯处理后,人胚肺成纤维细胞胶原表达量降低,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达减少,即Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达活性降低,人胚肺成纤维细胞胶原蛋白合成能力下降,导致成纤维细胞分泌胶原蛋白量明显减少,与文献[6,7]报道一致。

综上所述,青蒿琥酯具有抗纤维化作用,可在一定程度上降低胶原的分泌,其机制可能为下调Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达。

[1]张佳丽,王增,庄蓓蓓,等.二氢青蒿素联合环氧化酶 2抑制剂抗S180肉瘤作用机制研究[J].中国药理学通报,2009,25(3)：308-312.

[2]许光兰,梁劲松,以敏,等.转化生长因子 β1在博莱霉素诱导肺纤维化大鼠肺泡灌洗液中的表达及青蒿琥酯的干预作用 [J].广西医学,2008,30(8)：1119-1121.

[3]青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞系 HFL-I细胞增殖、凋亡的影响及机制[J].山东医药,2010,50(3)：33-35.

[4]赵洪文.肺成纤维细胞在肺纤维化中的作用[J].国外医学：呼吸系统分册,1996,16(3)：116-117.

[5]侯杰,戴令娟.川芎嗪、丹参治疗大鼠肺纤维化对Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响[J].中华结核和呼吸杂志,1999,22(1)：43-44.

[6]余欣,欧阳五庆,张黎,等.玉米幼芽提取物对小鼠皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达的影响[J].西北农林科技大学学报, 2007,35(7)：15-18.

[7]马捷,陈丽华,廖荣,等.蒿甲醚、双氢青蒿素对小鼠硬皮病模型的影响[J].中国中药杂志,2009,34(2)：207.