植物凝集素在抗刺吸式害虫转基因工程中的应用

张小霞， 曹素梅， 梁振普， 乔冠华， 许 锋， 陈晓慧

（河南农业大学生命科学学院，郑州 450002）

当今农业生产中，虫害是造成农作物重大产量损失的主要原因之一，严重制约了农业经济的稳定发展。传统的化学杀虫方法对农业的丰产增收起到了至关重要的推动作用，但是随着时间的推移，化学杀虫剂的弊端逐渐暴露出来。化学杀虫剂的使用不仅增加农业成本，还会造成农药残留、害虫产生抗药性、杀灭天敌等破坏自然生态平衡的严重问题。于是，生物防治方法日渐受到植保工作者越来越多的关注。特别是自20世纪80年代以来，随着植物基因工程的迅速崛起，有关人员把目光投向了抗虫转基因植物方向。目前，已有多种抗虫基因被转入植物中，并取得了良好的抗虫效果，尤其是转基因Bt棉，有效控制了鳞翅目、鞘翅目等害虫，减少了化学农药的使用量和次数，目前已大面积推广与应用。

刺吸式害虫因其独特的取食特点给防治带来了很大难度，它不仅会造成植物营养成分的流失，还是植物病毒传播媒介，严重影响了农作物的产量和质量。鉴于转基因植物的抗虫有效成分属于内源性表达的物质，因此此类杀虫方法在刺吸式害虫的防治方面具有独到的优势。

有报道称，不同来源的植物凝集素对同翅目、鞘翅目等害虫有毒杀活性。当植物受到伤害时，植物凝集素就会特异结合到昆虫消化道上，影响昆虫营养物质的吸收，抑制昆虫的生长，进而有杀虫作用，因此可以用来进行抗刺吸式害虫的转基因研究及应用。但有些植物凝集素对哺乳动物也有显著毒性，不适合用于转基因工程。这就需要在研究过程中，通过分子生物学手段，筛选并改良出高效、安全的抗虫凝集素基因，以满足刺吸式害虫防治的需求。针对目前的研究进展和研究热点，本文就植物凝集素基因的特点及其在抗刺吸式害虫转基因工程中的应用做较为详细的阐述。

1 植物凝集素及其作用方式

自从1888年Stillmark首次在蓖麻种子中分离纯化到一种植物凝集素—伴刀豆球蛋白Concanavalin A（ConA）以来，人们已经分离纯化了上百种植物凝集素。随着对它们的性质、结构和功能研究的深入，植物凝集素的定义也处于修正状态中。目前一般认为，植物凝集素指含有一个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的植物蛋白［1］。凝集素在自然界中分布非常广泛且在植物体内含量非常丰富，它在植物不同发育阶段，以不同的方式保护着植物免受病虫害的侵害，是植物防御系统的重要组成部分。植物凝集素作为植物的防御蛋白，其确切的作用机制目前还不十分清楚。一般认为，当凝集素被昆虫吞食至消化道时，可能有以下几种作用方式：一是结合到围食膜的几丁质上；二是结合到消化道上皮细胞暴露的糖络合物；三是结合到糖基化的消化酶上。这些结合影响营养物质的吸收，同时还可能在消化道内诱发病灶，引发细菌、真菌及病毒的感染，抑制昆虫的生长发育和繁殖，使害虫得病甚至死亡［2－4］。

采用cDNA克隆等分子生物学技术，已经分离获得了一些凝集素的基因及其转基因植物，并对这些转基因植物的抗虫性进行了研究。目前成功运用到植物抗虫基因工程中的凝集素有：雪莲凝集素（Galanthusnivalisagglutinin，GNA）、半夏凝集素（Pinelliaternataagglutinin，PTA）、麦胚凝集素（Wheat gerMagglutinin，WGA）、苋菜凝集素（Amaranthuscaudatusagglutinin，ACA）、豌豆凝集素（P－lectin）等。

2 常见植物凝集素的特点与应用

2.1 雪莲凝集素

雪莲凝集素是从石蒜科（Amaryllidaceae）雪花莲中提取出来的一种植物凝集素。GNA分子是每个亚基为12.5ku的四聚体蛋白，每个凝集素单体有3个相同的结合甘露糖的位点。4个GNA单体构成一个具有几个充分暴露的结合甘露糖位点的蛋白，因此它是一种专一识别甘露糖的蛋白质。GNA具有运输昆虫神经肽的功能，发挥该功能的片段由105个氨基酸残基组成，包括3个重复的约25个氨基酸残基的同源片段，可以用来作为标记以研究昆虫嗅觉通讯［5］。GNA对昆虫的作用部位经研究认为主要是在中肠的表皮细胞。通过免疫定位研究发现，GNA在褐飞虱体内的结合位点是在中肠的碳水化合物域。另外，在褐飞虱的脂肪体、卵巢管以及整个血淋巴中均发现有GNA的存在，说明GNA可以借助其甘露糖结合特性，穿透中肠壁进入到昆虫的循环系统，引起系统中毒反应［6－7］。

由于GNA对叶蝉、烟草夜蛾、蚜虫等咀嚼式和刺吸式昆虫具有普遍的抑制作用且对高等动物的毒性较小，因此GNA比较适合于抗虫转基因研究。目前，运用转基因技术成功转入GNA基因的植物有许多种，例如：烟草、水稻、小麦、葡萄、油菜等，这些植物均表现出了良好的抗虫效应［8］。周岩等［9］报道转GNA基因烟草能够抑制桃蚜（Myzuspersicae）45%～60%的虫口密度，有的高达90%以上。Hilder等［10］报道转GNA烟草对桃蚜的平均抑制率为50%。王关林等［11］用GNA基因转化菊花，得到的最高蚜口密度抑制率为84%，高于转基因烟草。梁辉等［12］研究表明，转GNA基因小麦对禾谷缢管蚜在接种当代即表现出明显的毒杀作用；对麦长管蚜，则表现为使虫体发育减缓，并且若蚜成活率降低。这些试验数据都说明了GNA对害虫有明显毒杀作用。但是，由于抑制率等数据是在试验条件下计算得到的，因此当实际应用到大田中时，受多种因素影响，这些数据可能还需要进行修正。

值得注意的是，有研究者认为GNA低水平表达不仅不会毒杀害虫，反而可能促进害虫的生长［13］。另外，作物大面积连片种植时，害虫可能趋向于食用邻近的未转基因作物而不食用转基因作物，从而影响抗虫效果。GNA的抑虫率还受大田整体的虫口密度等影响。因此，GNA转基因植物的构建方法及其田间应用技术都需要深入研究。

2.2 天南星科植物凝集素

2.2.1 半夏凝集素（PTA）

天南星科半夏为我国特有的多年生草本药用植物，其块茎为多用途中草药。PTA属于单子叶植物中甘露糖凝集素家族，其单体分子量为12，065u。PTA由4个相同的亚基组成，据朱黎［14］的推测该凝集素为不含糖链的蛋白，对热和酸碱均具有相当的稳定性，可以特异地凝集兔、鼠的红细胞，对肿瘤细胞的生长具有抑制效应。另外，PTA具有抑制病毒侵染的作用，研究者认为其作用机制是：PTA通过与病毒粒子外壳蛋白表面的糖链结合，把病毒粒子凝集在一块，从而导致病毒粒子的侵染力下降。

最先是黄大昉等［15］发现掌叶半夏和半夏的总蛋白具有抗同翅目蚜虫的作用。他们用棉蚜和麦蚜进行生测试验。结果显示，人工饲料中含活性蛋白时，两种蚜虫的成活率明显下降。随后潘映红等［16］的试验显示，具有抗同翅目蚜虫作用的是半夏凝集素蛋白。经试验处理后的蚜虫繁殖率明显下降，所产若蚜死亡率明显高于对照。姚剑虹用PTA的粗提液进行生测试验，结果显示其对棉蚜、桃蚜具有明显的杀虫效果，杀虫能力与GNA相似，提出PTA可以作为一种抗虫基因转入植物体内［17］。张红宇等［18］首次将PTA基因导入水稻中，并对其抗虫性及遗传稳定性进行了分析。转PTA基因水稻的纯系对褐飞虱的存活率和发育进度有明显的抑制作用。孔维文［19］把PTA和高赖氨酸蛋白基因导入超级水稻中，以期得到抗虫性和高赖氨酸表达的水稻植株。

PTA是一种有效的抗虫基因，对蚜虫的致死效应和GNA相似。但也有文献认为，PTA对哺乳动物有显著毒性，不适合用来作为抗虫基因转入植物体内。因此，关于PTA的生物安全性还有待于做进一步的研究。

2.2.2 天南星凝集素 （Arisaemaheterophyllumagglutinin，AHA）

天南星科植物天南星是一种中国药用植物，从它体内提取的天南星凝集素AHA和其他天南星科植物凝集素一样，对刺吸式昆虫具有毒杀作用。根据赵秀云博士论文研究，AHA的cDNA全长1 169bp，编码一个258个氨基酸的蛋白。AHA也是甘露糖结合凝集素家族的一个成员，其上含有3个甘露糖结合位点，其中2个位点比较保守，第3个略有差异。对AHA的高级结构分析认为，AHA由12条β折叠片组成，片层之间有转角和卷曲连接形成一个牢固的结构，与其他甘露糖结合凝集素的三维结构高度相似［20］。

根据李润植等［21］的报道，天南星凝集素不仅对棉蚜有明显致死活性，而且对其生殖发育有明显抑制效应，从而可能影响其种群的扩展。毛雪等［22］对4种植物凝集素的抗蚜效应进行了研究，棉花凝集素（Gossypiumhirsutumagglutinin，GHA）和蓖麻凝集素（Ricinuscommunisagglutinin，RCA）在高浓度下（2.0g／L以上）才显示明显的抑制作用，GHA作用稍大于RCA。只有天南星凝集素（AHA）在较低浓度（1.0g／L）时，就表现出明显的抑制效应，饲喂6d时，生存率即降低26%。赵秀云的研究也显示：在转化AHA基因的烟草上，蚜虫种群扩展速度明显比在非转基因植株上慢。这些研究显示出AHA是具有抗虫活性的蛋白，可以用于控制同翅目害虫，AHA基因是具有应用前景的新抗虫基因。

2.2.3 海芋凝集素（Alocasiamacrorrhizalectin，AML）

海芋为天南星科多年生常绿草本植物，是著名的抗癌中草药。海芋凝集素的cDNA全长为1 124bp，包含270个氨基酸。前23个氨基酸为信号肽，经切割以后，成熟的AML有247个氨基酸，相对分子量为29.7ku。该蛋白无糖基化位点，等电点为5.75，稳定性比较高。AML和天南星家族凝集素及相似蛋白具有很高的同源性，二级结构有很多的无规则卷曲，彼此通过转角和卷曲连接，构成一个十分紧凑的结构。AML也是识别甘露糖接合位点的一种蛋白质，有3个甘露糖结合区［23］。

对AML抗虫性进行研究的主要是潘科等人。他们最先用海芋凝集素粗品和纯化后的凝集素研究了对豆蚜的抗生作用。研究认为AML对豆蚜有忌避作用和较强的杀虫活性。对豆蚜的生殖和蜜露分泌也有一定影响。随后又对几种鳞翅目昆虫采用不同的喂食方法，研究得出AML的主要杀虫方式是以胃毒为主。并且结合前面的研究认为AML对同翅目害虫的毒杀作用比对鳞翅目害虫强。因为利用昆虫离体细胞进行杀虫活性物质筛选相较昆虫生物测定有一定的优势，所以他们研究了AML对4种不同的昆虫离体细胞的毒杀作用。用AML处理昆虫细胞24h就使大部分细胞破坏消失，说明AML是一个较强的杀虫蛋白，可以作为一个新的抗虫基因，值得对其进行多方面的研究［24－26］。但是，目前还未见利用基因工程手段把AML基因导入植物中，研究其对害虫影响的报道。

2.3 苋菜类凝集素

苋菜类凝集素是一个小的凝集素家族，目前发现的不超过10种。它们都是由2个同源亚基以头—尾方式排列而形成的二体。亚基有2个同源的结构域：N－和C－端结构域。糖结合位点在N－和C－结构域连接的表层凹穴中［27－28］。苋菜类凝集素对2－乙酰氨基－2－脱氧－D－半乳糖具有特异性，且其氨基酸序列和高级结构与其他植物凝集素不同。各种不同来源的苋菜类凝集素抗虫能力也不尽相同。

郭洪年等［29］研究了尾穗苋凝集素（Amaranthus caudatusagglutinin，ACA）在植物中的抗虫作用。用ACA转化烟草，用桃蚜对转基因植株进行接虫试验。结果显示，78%的参试烟草对桃蚜蚜口密度增长的平均抑制率在75%以上，在抗性植株上观察到有桃蚜若虫死亡的现象。周永刚等［30］从苋属植物千穗谷中扩增出苋菜凝集素（Amaranthushypochondriacusagglutinin，AHA）并通过农杆菌转化了烟草。转AHA烟草抗虫试验表明，含内含子的AHA和不含内含子的AHA烟草对蚜虫的平均抑制率分别达57.2%和48.8%。邓智年等［31－32］从野苋菜中克隆了野苋菜凝集素（Amaranthusviridisagglutinin，AVA）片段。转化白菜后，生测试验显示，转AVA基因的白菜可以抑制桃蚜的群体发展，平均抑制率为55.8%。有内含子和无内含子的AVA转化烟草，得到的转基因烟草抗蚜率分别为60.81%和50.63%。Wu等［33］把 ACA 基因导入棉花中，对棉蚜的抑制率达64.5%。

从以上研究可以看出，不同来源的苋菜类凝集素抗虫效果不尽相同，这可能是由于各种苋菜类凝集素氨基酸组成有差异，进而在高级结构上造成差异，从而影响其抗虫效果。另外用含有内含子和不含内含子的基因转化植株，得到的抗虫率也不相同，包含了内含子的植株比没有内含子的植株抗虫性能要稍微高一些。其原因可能是内含子的存在优化了目的基因的表达，利于mRNA的稳定和加工，提高了目的蛋白的表达量，使得植株的抗虫性提高。但是其确切的分子机制还有待于进一步的研究，研究结果将有助于人们进一步了解内含子存在的意义，也有利于揭示凝集素的作用机理，具有一定的科学理论意义和应用价值。

3 转双价抗虫基因的研究

由于转单价抗虫基因的植株在大田生产中存在一些潜在的问题。例如：抗虫谱窄，抗虫效果不太理想，容易使昆虫产生抗性等。因此通过不同抗虫基因之间的互补作用，构建转双价或多价抗虫基因的植物是研究者亟待解决的问题。

目前，转多价抗虫基因的研究少有报道，研究较多的是双价转基因植物。在农作物中，转入双价抗虫基因研究最多的是烟草、棉花和水稻等。王志斌等［34］采用GNA成熟蛋白基因与人工合成的GFMcryIA构建了双价基因中间载体，转化烟草并用棉铃虫进行试验，结果表明40%的转基因烟草植株具有高抗性；抗蚜试验表明其有效降低了蚜虫繁殖率，抑制蚜口密度为30%～50%，且获得了数株兼抗棉铃虫及蚜虫的烟草植株。赵存友等人用改造的全长雪莲凝集素基因与合成的带有分泌信号肽编码序列的Bt基因构建双价植物表达载体。对转化再生烟草的生测结果表明，利用这两个改造过的抗虫基因可以获得既抗虫又耐蚜的双抗转基因植物［35］。刘召华等［36］构建了ACA和改造后的GNA的双价植物表达载体。将ACA和GNA基因转化到烟草中，平均抑虫率达83.9%，且试验显示这两个基因的抗蚜功能可以稳定遗传。

转Bt基因抗虫棉的广泛种植给人们带来了巨大的经济效益和社会效益，但害虫对转Bt单基因抗虫棉的抗性是Bt棉进一步应用的潜在限制。为解决这一问题，1995年中国农科院生物技术中心率先构建了双价抗虫基因，并导入棉花。随后，转双价抗虫棉的研究日新月异。王伟［37］等将P－lec基因和SKTI基因转化陆地棉，抗虫测试表明，转基因棉株对棉铃虫幼虫具有较强的抗性。刘志等对转Bt和GNA双价基因抗虫棉的抗性进行了生测试验。结果显示，植株在不同生长期的主茎叶对棉铃虫幼虫具有很高的抗性，对棉蚜群体具有明显的抑制效果［38］。吕凯等人对转Bt＋CpTI双价基因抗虫棉和单价Bt棉的抗虫性进行了比较。生育前期双价抗虫棉及其杂交F1代的抗虫性略弱，但差异不显著，生育后期双价抗虫棉及其杂交F1代的抗虫性显著强于Bt基因棉［39］。

在国外，研究转双价抗虫基因的工作仍以Bt基因为主选基因。工作重点大多是对Bt基因进行修饰或将Bt基因的不同区段进行重新组合进而得到抗虫效果比较好的转化植株。Anwaar［40］等把cry1Ab和cry1Ac基因组合起来，构建植物表达载体转化印度香米370并检测了其抗虫性。接虫5d后，转化株的害虫死亡率达到了100%，非转化株为42.5%。转化株叶面积损害指数为4%～16%，非转化株为82.5%，抗虫效果非常显著。Samir［41］等把编码Cry1Ba蛋白的Domains I和III与Cry1Ia蛋白的Domain II组合起来形成嵌合基因SN19，转化到马铃薯中，获得了既抗鞘翅目又抗鳞翅目害虫的转化植株且抗虫效果显著。Singh等把天然的cry1Ea和cry1Ca进行组合，形成了编码Cry1EC蛋白的基因。抗虫试验显示，成功转入Cry1EC基因的棉花和烟草对甜菜夜蛾各个虫龄的致死率均为100%［42］。除了上述转化两种不同Bt基因的研究外，还有把Bt基因和其他植物凝集素结合起来的研究报道。例如：Maqbool等把两种Bt基因（cry1Ac和cry2A）和GNA组合起来转化印迪卡水稻M7和印度香米370，生测试验显示，转三价植株对稻纵卷叶螟和三化螟致死率100%，对褐飞虱致死率25%，抗虫效果非常明显［43］。Luke等把Bt基因和蓖麻毒素B链（RB）结合起来形成BtRB融合蛋白，他们把该基因转化进玉米和水稻，研究了其抗虫性和对昆虫遗传的影响。转化BtRB的玉米植株对二化螟的致死率为75%，表达BtRB的水稻对二化螟的致死率为60%～90%［44］。

无论是两种植物凝集素组合还是两种Bt基因组合或者是Bt基因和凝集素组合，其抗虫效果都比仅含一个基因的好，并且抗虫谱较宽，能延缓害虫产生抗性的时间。因此构建多价或双价抗虫转基因植物，使其产生抗虫性的同时又减缓害虫产生抗性的速度，不破坏生态平衡，是今后植物抗虫基因工程的一个主要研究方向。但是在实际的大田应用中，同时种植转单价和双价抗虫基因的植物，有可能会掩盖转双价植株延缓昆虫产生抗性的优势。据Zhao的研究结果显示，同时种植转单价（如Cry1Ac或Cry1C）和转双价（如Cry1Ac和Cry1C）Bt棉时，双价Bt棉上的小菜蛾存活率比单独种植双价Bt棉的存活率要高。因此，为了延缓害虫产生抗性，应尽量避免混合种植转单价和双价抗虫棉［45］。

4 结语与展望

刺吸式口器害虫种类繁多，包括同翅目、半翅目、蚤目及部分双翅目昆虫，形态和生理特征特殊，具有体形小、繁殖快、后代数量大等特点。有很多刺吸式昆虫是植物病毒传播媒介，它们不仅严重影响农产品的产量，而且造成了农产品质量下降。因此，培育转基因抗虫农作物非常重要。

目前，植物凝集素的转基因抗虫工程研究大多集中在对GNA的研究上。迄今为止GNA基因已成功转入马铃薯、番茄、烟草等9种作物中，研究证明GNA对刺吸式口器昆虫如蚜虫、褐飞虱等同翅目昆虫有特效，但其大田应用时的抗虫效果不是很理想。另一方面，研究表明GNA在低浓度时对害虫反有促进生长的作用［13］，所以要求转GNA的植株具有相对较高的表达水平，才能有较好的抗虫效果。因此，关于该基因的高效表达、转基因植株的应用技术方面还有待于做深入的研究。

天南星科植物为我国特有的中草药植物，从植物体内提取的凝集素有很好的抗虫效果。PTA的杀虫活性和GNA相似，但是其生物安全性成为限制其进一步研究应用的主要因素。今后要加强其抗虫机理的研究，改造或者删除对哺乳动物有毒性的基因片段，只利用对害虫有毒杀活性的基因片段转化植株，从而得到不存在生物安全隐患的抗虫新品种。由于内含子的存在与否影响苋菜类凝集素的抗虫效果，因而需要加强该类凝集素内含子作用机理的研究，进一步阐明该类凝集素的抗虫原理，以便为转基因提供理论基础。为了更好地推进抗虫基因工程的开展，在以后的研究应用中，要更加注重筛选新型、高效的抗虫基因，并深入开展其抗虫机理、安全评价、不同抗虫基因之间的协同互补作用等研究，通过分子生物学手段改良出安全、高效的双价或多价抗虫转基因作物。

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