真菌抗原检测在侵袭性真菌感染中的诊断价值

张晓艳 综述 赵顺英 江载芳 审校

近年来由于造血干细胞、实体器官移植的广泛开展、高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的应用，以及各种导管的体内介入、留置等，临床上侵袭性真菌感染(IFI)的发生率和病死率呈明显上升趋势，其预后改善有赖于早期诊断和及时有效的抗真菌治疗。然而由于IFI的临床表现不典型且易被原发病掩盖，致使早期诊断十分困难。真菌培养和组织活检是IFI诊断的金标准，然而由于所需时间长、敏感度较低以及有时因患者的病情而难以获得组织标本，无法满足临床诊断的需要。近年来开展的真菌抗原检测，尤其是半乳甘露聚糖(galactomanna,GM)和1,3-β-D葡聚糖(BG)检测作为一种非侵袭性诊断方法，有着早期、快速、高灵敏度和特异度的优点，先后被欧洲国家、美国及中国制定的IFI诊断和治疗指南列为临床诊断IFI的微生物学标准之一。本文就真菌抗原检测在IFI中的诊断价值做一综述。

1 GM

GM是曲霉菌细胞壁上的一种多糖抗原。Latgé等[1]从体外曲霉菌培养的上清液提取分析了GM的结构，GM在体外是一种单纯多糖，相对分子质量约为20 000，其共有结构是由α-1，2和α-1，6糖苷键聚合而成的甘露聚糖核心及由β-1，5呋喃半乳糖残基组成的具有抗原活性的侧链构成。GM的抗原表位为其侧链上的β-1，5半乳呋喃糖，GM的抗原表位数目在不同的曲霉菌株和菌种有所不同。

GM在曲霉菌丝向组织侵袭性生长时释放进入血液循环，这种抗原血症可持续存在1～8周[2]。已有的商品化试剂盒采用乳胶凝集法(LA)和ELISA法检测GM，两者均使用抗GM单克隆抗体,但由于实验方法不同,其敏感度和特异度存在较大差异。LA可检测出血清中GM 15 μg·L-1，而此时患者已生命垂危，开始治疗意义不大[3～5]，因此限制了其临床应用。20世纪90年代初发展的ELISA法，利用鼠抗GM单克隆抗体检测循环中的GM，其灵敏度达0.5～1 μg·L-1。Maertens等[6]关于ELISA检测血清GM对血液病患者IFI诊断价值的研究结果显示，若以2次吸光度指数≥1.0为阳性判定界值点，实验总敏感度为92.6%，特异度为95.4%，阳性预测值和阴性预测值分别为93%和95%，50%以上患者在出现临床症状前即可检出血中抗原。对高危患者进行动态检测(每周2次)更具有早期诊断价值。2003年，美国FDA完成对该实验的临床评价, 其敏感度为80.7%,特异度为89.2%,早期诊断优势突出，并批准GM实验用于非免疫缺陷患儿侵袭性曲霉菌病(IA)的辅助诊断。

近年将ELISA检测血清GM与胸部CT结合作为抢先治疗的起点，不仅降低了病死率，同时提高了诊断IA的准确性，减少了过度经验性用药的毒性作用和费用[7，8]。多项研究显示，血清GM水平与组织的真菌负荷量成正比，动态监测血清GM水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果[2，6，9，10]。需要注意的是，有文献报道在使用棘白菌素类的抗真菌药治疗后，临床症状改善并不一定伴有血清GM滴度的下降[11]。在兔IPA模型中，Francesconi等[12]发现三唑类抗真菌药可显著降低支气管肺泡灌洗液(BALF)中的GM水平，而使用棘白菌素类药物治疗组BALF中的GM水平则持续升高，考虑可能与棘白菌素类药破坏真菌的细胞壁而不能将其彻底清除，使其胞壁抗原不断释放入周围组织中有关。

至今，关于ELISA检测血清GM在IA中诊断价值的研究结果均显示了较高的特异度(>85%)，然而敏感度差异较大(30%～100%)[13～20]。

被检人群的不同，感染的曲霉菌种以及实验相关的因素等均可对实验结果产生不同程度的影响。晚近，Pfeiffer等[21]对ELISA检测血清GM在IA中的诊断价值进行Meta分析，发现该实验在恶性血液病患者中的敏感度和特异度分别为70%和92%，然而在实体器官移植患者中的敏感度仅为22%，提示GM实验在恶性血液病或骨髓移植患者中的诊断价值优于实体器官移植患者。Balloy等[22]对由糖皮质激素和化疗药所致的免疫抑制IA小鼠进行研究，发现由糖皮质激素所致免疫抑制的小鼠，在其感染的肺组织伴有快速和大量的中性粒细胞浸润，肺、肾和脑组织中GM水平较低；化疗药所致免疫抑制小鼠的BALF中出现了大量的菌丝浸润和GM水平的显著升高(无多核细胞的浸润)，提示被测鼠群的不同，可显著影响实验的敏感度。

假阴性结果除与上述被测鼠群不同有关外，还与以下因素有关： ①判断阳性结果的界值点：起初欧洲国家多以1.5作为阳性判定界值点，Bio-Rod公司推荐的判定界值点也为1.5。美国FDA推荐的判定界值点为0.5。Ulusakarya等[13]以1.5作为阳性判定界值点，实验的敏感度和特异度分别为69%和96%，若将阳性界值点降至1.0则实验的敏感度可升至100%，而特异度降至92%。为确定一个最佳阳性界值点，Verweij等[23]对203例患者进行了检测，受试工作者特征(ROC)曲线分析结果显示，阳性界值点为0.5时的敏感度为97.4%，特异度为90.5%，阳性预测值和阴性预测值分别为66.1%和99.4%。目前以0.5为判定界值点已被欧洲国家和美国普遍接受。②宿主抗真菌治疗：Marr等[24]对67例患者的986份血清进行GM实验，显示在未接受抗真菌治疗患者的敏感度为80%，而经抗真菌治疗患者的敏感度仅为20%。 ③还可能与曲霉菌感染的严重程度、高滴度抗体和一过性抗原血症有关。文献报道在非侵袭性或侵袭程度较低的肺曲霉菌病(如曲霉球和气管支气管曲霉菌病)ELISA检测血清GM的敏感度较低，在慢性空洞性肺曲霉病患者血清ELISA GM检测的临床意义不大[25]。因真菌抗原血症是一过性的，样本采集频率较低，可能会降低实验的敏感度。目前推荐对高危患者每周检测2次。在可疑IA患者的敏感度一般较低，可使实验总的敏感度降低[16，26]。

血清GM检测对IA的诊断有较好的特异度，但有文献报道在儿童，尤其是小婴儿和新生儿的假阳性率则较高。一项包含成人和儿童的前瞻性研究显示，儿童的假阳性率为10.1%(34/338例),成人仅为2.5%(10/406例)[27]。另外一项研究同样显示，儿童的假阳性率显著高于成人(44%vs0.9%)[26]。Siemann等[28]对6例新生儿进行GM实验，其中5例呈假阳性结果。关于儿童中假阳性率较高的原因可能与婴儿或新生儿肠道内定植着大量的双歧杆菌有关，双歧杆菌的脂膜酸可与GM发生交叉反应；另外配方奶中含有较高浓度的GM，可能与通过尚未发育完整的肠黏膜进入循环而造成假阳性结果[29]。谷物、谷类食品和牛奶等食物中均含有GM，可通过受损的肠黏膜进入循环引起抗原血症，也可解释骨髓移植患者血清 ELISA GM检测的假阳性率在移植术后的第1个月最高，因为这一时期化疗药所致的肠黏膜病变最为严重[26]。静脉应用β-内酰胺类抗生素也可产生假阳性结果[30～32]，最近一项研究对15种抗生素进行了检测，结果显示氨苄西林的吸光度指数最高(0.54)，其次为哌拉西林-三唑巴坦(0.235)。除曲霉菌外，在其他真菌，尤其是青霉菌属的生长过程中也伴有GM的释放。在细菌感染患者也可出现假阳性结果，但相关机制尚不清楚，可能与抗生素的使用有关，而且目前尚未发现假阳性结果与何种细菌感染之间存在必然的相关性[33,34]。

2 BG

BG占真菌胞壁成分的50%以上，由D-葡聚糖聚合而成，以β-1，3糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链,分支状β-1，6糖苷键连接的葡萄糖残基作为侧链。除结合菌(主要是根霉菌和毛霉菌)外,所有真菌胞壁成分中都含有BG，以酵母样真菌含量最高,而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含BG。BG在真菌感染中的作用,可能与内毒素在革兰阴性杆菌感染中的作用类似,可刺激机体产生免疫反应，并被迅速清除。当真菌进入血液或深部组织后,经吞噬细胞的吞噬和消化等作用后,BG可从真菌细胞壁释放，从而使血液及其他体液(如尿液、脑脊液、腹水和胸水等) 中的含量升高。当真菌减少时,机体免疫系统将其迅速清除，而在浅部真菌感染时则无类似现象[35]。因此血浆BG水平升高已成为IFI的一个重要指标。

20世纪90年代初发现，马蹄鲎(主要是东方鲎和美洲鲎)凝血系统中的凝血酶原G因子能识别BG，是BG的天然检测者。BG与G因子的α亚基特异性结合后可激活β亚基，从而旁路激活鲎实验(内毒素主要激活的是鲎的凝血酶原C因子)此过程即为G实验。

目前市场上常用的试剂盒主要有两种，日本的Fungitec-G glucan试剂和美国的Glucatell试剂。Fungitec-G glucan试剂主要成分是东方鲎的细胞裂解产物，其判断标准为20 ng·L-1；而Glucatell试剂则使用了美洲鲎的细胞裂解产物作为主要原料，其判断标准的争议较多，目前推荐使用的判断标准为60 ng·L-1。

Obayashi等[36]研究G实验在真菌感染和真菌性发热中的诊断价值，检测了202例标本，100例有明确感染菌的患者中，37/41例(90%)确诊真菌感染患者中G实验阳性,59例其他原因所致的发热患者G实验均阴性；26/102例不明原因发热患者G实验阳性；将阳性结果判断为真菌感染，则真菌感染判断的阳性率为59%,阴性率为97%，有效率为85%。Ostrosky-Zeichner 等[37]对170名健康志愿者和163例确诊或可疑深部真菌感染患者进行了检测，结果显示以≥60 ng·L-1为阳性判定界值点,其总敏感度为69.9%,特异度为87.1%,阳性预测值为83.5%，阴性预测值为75.1%；深部念珠菌感染患者中的阳性率为81.3%，曲霉菌感染患者中的阳性率为80%，隐球菌感染患者中的阳性率为25%，毛霉菌和根霉菌感染患者检测结果均为阴性。Odabasi等[38]检测283例急性白血病或骨髓增生异常综合征患者不同时间点的血标本(在3周内每例患者平均采集7次)，结果显示以≥60 ng·L-1为阳性判定界值点，实验的敏感度和特异度分别为97%和90%～96%，阴性预测值为100%；所有真菌定植患者血浆BG水平均无显著升高；所有确诊或高度可疑IFI患者在出现明显的临床症状前，至少有1次G实验为阳性，同时血清GM水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果。

G实验可作为IFI的一种有效筛查方法，具有早期诊断价值。目前主要用于侵袭性念珠菌、曲霉菌感染高危人群的监测及疗效和预后的评估。其不足之处在于：①阳性结果只表示IFI，而不能确定是何种真菌；②不适用于结合菌和隐球菌感染的诊断，因根霉菌和毛霉菌胞壁中不含BG，隐球菌的胞壁中含量较少，且具有厚壁荚膜，不利于吞噬细胞的吞噬及抗原的释放[37，39]；③白蛋白、丙种球蛋白、香菇多糖、磺胺类药物及血液透析等均可导致假阳性结果。由于BG也存在于植物胞壁中，故纤维素类物质的使用可导致假阳性结果(如手术中使用的纱布和血液透析时使用的某些纤维素制品)。输注白蛋白和IVIG导致的G实验假阳性可能与在血液制品的加工过程中使用的纤维素薄膜过滤器有关[39～42]。

G实验和ELISA检测血清GM均可用于IA的诊断。Pazos 等[43]对40例中性细胞减少的IFI高危患者同时进行了G实验和ELISA检测血清GM, 结果显示两者的敏感度和特异度差异无统计学意义，但发现G实验有先于ELISA检测血清GM阳性的倾向，同时检测有助于识别假阳性,可将特异度提高至100%。

3 隐球菌荚膜多糖抗原

隐球菌的荚膜由多糖构成,利用LA检测隐球菌荚膜多糖抗原是目前临床上诊断隐球菌感染的最重要方法之一，已被广泛应用。

Bloomfild等[44]首先采用LA检测血清和脑脊液中的隐球菌荚膜多糖抗原，其生化原理是抗隐球菌蛋白与隐球菌荚膜多糖抗原反应可引起明显的凝集现象，与正常蛋白则不引起凝集。目前国内外报道LA的敏感度为93%～100%,特异度为93%～98%,由于采用试剂盒不同,结果存在一定差异[45]。Antinori等[46]对多个国家以往隐球菌抗原检测的报道进行综合评价，隐球菌抗原检测脑脊液中的阳性率为94.1%，在血清中的阳性率为93.6%；在不同的免疫宿主人群中，隐球菌抗原检测的敏感度稍有差异。在HIV阳性的隐球菌脑膜炎患者中，血清和脑脊液中隐球菌抗原检测的阳性率分别为98.9%和92.2%；在HIV阴性的其他免疫功能缺陷的隐球菌脑膜炎患者中，血清和脑脊液中隐球菌抗原检测的阳性率分别为87.2%和97.7%；在免疫功能正常的隐球菌脑膜炎患者中，血清和脑脊液中隐球菌抗原检测的阳性率分别为92.3%和98.9%。

多项研究显示，经有效抗真菌治疗后，临床症状改善常伴有荚膜多糖抗原滴度的下降，而病情加重或复发患者则有滴度上升，因此利用LA检测隐球菌的荚膜多糖抗原不仅有助于早期诊断，还可用于疗效和预后的评估[47,48]。对于荚膜多糖抗原阳性的患者，经有效治疗后,真菌培养和涂片转阴，抗原滴度呈下降趋势，但需要注意的是直至真菌培养、涂片全转阴时,多数患者的LA结果往往仍呈阳性,考虑可能与死亡的隐球菌仍持续释放荚膜多糖抗原,而机体清除此类抗原相对缓慢有关[49]，提示在疾病后期抗原滴度的变化对治疗的指导作用有限。同时有研究报道，荚膜多糖抗原阳性在有隐球菌感染史AIDS患者的临床意义难以确定，因为这种抗原血症可持续存在数年之久，且抗原滴度的变化与有无复发之间无相关性[46,50]。

系统性红斑狼疮、结节病、类风湿因子、巨球蛋白及毛孢子菌属均与隐球菌荚膜多糖抗原存在交叉抗原,可引起假阳性结果；操作过程中乳胶手套中的滑石粉也可引起假阳性结果[51～53]。此外有报道在结核性脑膜炎患者也可出现假阳性结果，考虑可能与其血清中存在与隐球菌有交叉抗原的成分有关[52]。假阴性结果考虑与循环中的抗原水平尚低有关，在肺隐球菌病单独存在而未发生肺外播散时，血清隐球菌抗原检测可为阴性。高浓度隐球菌抗原所致的钩带现象和体内未知非特异性蛋白，可对隐球菌抗原产生掩盖效应,可引起假阴性结果[51～53]。此外还应关注荚膜缺失的隐球菌所致慢性脑膜炎，此时也可呈假阴性结果[54]。

4 其他抗原成分

甘露糖广泛存在于真菌胞壁中,是真菌胞壁的重要组成成分,在真菌致病过程中甘露糖参与了免疫调节和防御，同时抗甘露糖抗体具有保护性作用。Kume等[55]采用Pastorex 法检测深部念珠菌血症,其敏感度和特异度分别为91.7%和28.6%，但该法不与克柔念珠菌的甘露糖发生反应,故不能应用于克柔念珠菌病的诊断。另外，由于甘露糖广泛存在于各种真菌细胞中,导致该检测方法特异度较低,限制了临床应用。

烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油盐水解酶)广泛存在于真菌细胞中,目前研究较多的是念珠菌属的烯醇化酶，其大量释放与深部念珠菌感染有关。Walsh等[56]通过检测血标本白色念珠菌烯醇化酶抗原确定是否存在深部真菌感染，结果显示敏感度为75.0%,特异度为95.9% 。但该酶抗原性强，在体内清除较快，故检测其抗体显然更为有效。

Cand-Tec抗原是指可采用念珠菌属检测系统(一种颗粒凝集试验系统) 检测的一类念珠菌蛋白抗原,但文献报道的敏感度和特异度不尽相同，加之类风湿因子可导致假阳性结果，目前其临床应用价值有限。

目前，侵袭性深部真菌感染的最终诊断仍需结合临床及传统的诊断方法。由于各种诊断方法均有其优势和局限性，将各种诊断方法结合可提高诊断的准确性，寻找更具代表性的检测物质，广泛利用新技术提高检测速度、灵敏度和特异度，建立新的诊断方法，是IFI早期诊断研究的发展方向。因此，真菌抗原成分检测对IFI的早期诊断具有重要价值，且可通过对抗原滴度变化的监测来判断疾病的严重程度、抗真菌治疗的效果及预后。

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