对藏药四味雪莲花颗粒中含量测定方法的改进

张秀峰

(青海省药品检验所，青海西宁810000)

四味雪莲花颗粒收载于《国家中成药标准汇编》(中成药地方标准上升国家标准部分)内科心系合成分册［1］。由红景天、雪莲花、大黄、蕨麻四味藏族传统用药组成。藏医用于三大因素平衡紊乱，隆，培根功能失调，气血上升，血瘀痰阻所致的高脂血症［1］。原标准中含量测定为高效液相色谱法测定大黄素含量，本实验用高效液相色谱法同时测定大黄素、大黄酚的总量。此法简便、稳定、重现性好，能够更好的控制四味雪莲花颗粒的质量。

1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪，Agilent G1314 VWD紫外检测器，HP化学工作站(美国Agilent公司);电子天平(SartoriusBT224S，北京赛多力斯仪器公司);电子天平(SartoriusR200-D，北京赛多力斯仪器公司);电子天平(METTLER PB1502-S，瑞士 METTLER公司);超声波清洗器(B2500s-MT，上海必能信超声波清洗仪有限公司)。

大黄素对照品(110756-200110)，大黄酚对照品(110796-200412)均由中国药品生物制品检定所提供，为含量测定用。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水;四味雪莲花颗粒样品与阴性药材由青海金诃藏药药业有限责任公司提供，样品批号分别为:081101、081102、081103。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:依利特Hypersil-ODS2 柱(250 mm ×4.6 mm，粒径 5 μm);柱温:室温;流动相:甲醇－0.1%磷酸溶液(80∶20);检测波长:254 nm;理论板数按大黄素峰计算，大于10 000(应不低于3 000)。

在上述色谱条件下，得到四味雪莲花颗粒供试品及大黄素、大黄酚对照品色谱图，大黄素的保留时间在8.5 min左右，大黄酚的保留时间在11.3 min左右。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品9.93 mg，大黄酚对照品27.55 mg分别置250 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀;分别精密量取上述大黄素对照品溶液4 mL，大黄酚对照品溶液2 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀释置刻度，摇匀即得混合对照品溶液(大黄素对照品溶液浓度为1.588 μg/mL，大黄酚对照品溶液浓度为2.204 μg/mL)。

2.3 供试品溶液制备 取本品装量差异下内容物约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置100 mL锥形瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸液10 mL，超声处理2 min(50 Hz，120 W)，再加三氯甲烷10 mL，加热回流 1 h，放冷，移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次约10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备 按照处方的组成，取除大黄外的其余药味，按制备工艺要求制成不含大黄的制剂，按供试品溶液制备项下的方法制备阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪。供试品色谱图中，在与大黄素、大黄酚对照品色谱图相应保留时间上，分别有相同的色谱峰，而阴性对照在此无干扰。

2.5 线性考察 分别精密吸取上述已配制好的大黄素(浓度为1.588 μg/mL)与大黄酚(浓度为2.204 μg/mL)对照品混合溶液 2、4、8、12、16、20 μL，按上述条件分别注入色谱仪测定，以对照品溶液进样量(μg)为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程得:大黄素Y=6.081 1X－0.104 7，r=0.999 9，大黄素进样量在 0.003 176～0.031 76 μg范围内与峰面积呈线性关系;大黄酚Y=11.883X －0.957 8，r=0.999 9，大黄酚进样量在0.004 41～0.044 1 μg范围内与峰面积呈线性关系。

2.6 精密度考察 精密吸取上述已配制好的大黄素对照溶液(浓度为1.588 μg/mL)，大黄酚对照溶液(浓度为2.204 μg/mL)，连续进样5次，每次进样量为10 μL，按色谱条件操作进行，测峰面积，以峰面积计算大黄素RSD=0.3%，大黄酚RSD=0.9%，结果表明:大黄素、大黄酚测定方法精密度良好。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液(批号:081103)，按上述色谱条件分别于 0、2、4、6、8、12 h 进样量 10 μL，测定峰面积的大黄素RSD=3.0%，大黄酚RSD=1.3%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 重复性试验 按照上述含量测定方法对相同批号(081103)样品制备5份供试液，分别进样10 μL，测定峰面积，结果大黄素RSD=1.6%，大黄酚RSD=1.4%，说明本方法重现性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取大黄素2.55 mg，大黄酚4.28 mg置250 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，配制成每1 mL含大黄素为0.010 2 mg，大黄酚为0.017 10 mg的混合溶液。取已知含量的四味雪莲花颗粒样品(批号081103，大黄素含量为0.064 2 mg/g，大黄酚含量为0.102 9 mg/g)0.25 g，称取9份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液1、1.5、2.5 mL各3份，按上述供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定大黄素与大黄酚的含量，计算回收率。结果平均回收率大黄素为98.1%，RSD=2.1%;大黄酚为98.9%，RSD=2.3%。结果表明本方法加样回收较好，结果见表1、2。

2.10 样品测定 按上述含量测定方法，对3批样品中所含大黄素、大黄酚的总量进行含量测定，结果见表3。

2.11 原方法测定结果与改进后方法测定结果比较 原标准测定结果与改进后的方法测定结果见表4。

测定结果表明，原标准中大黄素含量低于万分之一，改进后测定结果及数据均高于万分之一，对于制剂质量的控制更有意义。建议将原标准中单测定大黄素含量改进为同时测定大黄素、大黄酚的含量。

表1 大黄素回收率测定结果

表2 大黄酚回收率测定结果

表3 样品测定结果

表4 2种测定方法结果比较

3 讨论

3.1 本次试验对大黄素和大黄酚进行紫外全波长扫描，大黄素、大黄酚在254 nm和436 nm处都有最大吸收，参照2005版《中国药典》一部［2］大黄药材的含量测定项，选择波长为254 nm进行检测，样品主峰分离度较好，且阴性对照无干扰。

3.2 参照2005版《中国药典》［2］一部中大黄药材含量测定方法测定四味雪莲花颗粒样品，色谱峰分离度和峰形并不理想，后改用甲醇－0.1%磷酸溶液(80∶20)作为流动相，20 min内出峰完成，且分离度较好。

3.3 在试验过程中，我们考察了超声30、45、60、75 min和回流30、45、60、75 min提取样品中大黄素和大黄酚的含量，发现回流的样品含量总体高于超声提取，且45 min和60 min，75 min大黄素、大黄酚的含量相差不大，所以本研究回流45 min作为本次样品的提取方式。

［1］国家中成药标准汇编(中成药地方标准上升国家标准部分)内科心系分册［S］.2002:156-159.

［2］中国药典［S］.一部.2005:17-18.