TNF-α基因多态性与肠结核患者胸腺肽-alpha1治疗前后T淋巴细胞亚群变化的相关性研究

梁旭峰，梁 虹，汪关宝，矫秀红(1.北京市中关村医院，北京市 100190;.鸡西市人民医院，鸡西市158100)

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种潜在的免疫调节剂和重要的炎性细胞因子，一般出现在炎症反应的早期，具有多种生物学活性。近年来国外有研究发现，人群中不同的TNF-α基因型可能决定了不同个体间TNF-α的表达与功能上的差异，进而影响到体内TNF-α的最终生物学效应［1］。因此，TNF-α的不同基因型有可能作为重要的基因背景，决定了不同人群对于某些炎症疾病有着不同的免疫调节作用，进一步导致了不同的临床特征。胸腺肽-alpha1是一种人工合成的生物制剂，具有增强细胞免疫功能的良好效应，近年来在恶性肿瘤、免疫缺陷性疾病，结核感染等的治疗中取得了较好的临床效果［2］。本研究在传统抗结核化疗方案基础上加用胸腺肽-alpha1治疗肠结核(intestinal tuberculosis)患者，并探讨 TNF-α基因多态性对肠结核患者胸腺肽-alpha1治疗前后T淋巴细胞亚群变化的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

研究病例均为2006年6月—2009年6月在中关村医院(29例)与鸡西人民医院(37例)门诊或住院就诊的患者。总计66例，治疗方案为:抗结核 +胸腺肽 -alpha1治疗，其中男31例，女35例，年龄27～63岁，平均年龄(42.82±6.74)岁。试验方案经北京市中关村医院临床研究伦理委员会批准。在签署知情同意书后，收集患者年龄、性别等人口学资料、临床资料及实验室检查资料。所有病例临床资料完整，研究人群均系中国汉族人群，个体之间均无血缘关系。诊断标准:肠结核诊断根据其病史、临床表现、PPD试验、内镜、X线影像、病理改变、抗酸染色而确诊。所有患者的诊断应必须至少满足下列一个或更多的条件:消化道内镜明确的干酪性肉芽肿;涂片或组织切片示抗酸杆菌阳性;源自组织标本中的抗酸杆菌培养阳性;肠镜结果强烈提示典型肠结核结并同时合并有活动性肺结核。纳入标准:根据以上诊断标准纳入的研究对象均排除有免疫相关或免疫性疾病、克罗恩病、肉芽肿性炎症、溃疡性结肠炎、肠道肿瘤，以及心、肝、肾等基础疾病。排除标准:试验开始前已开始抗结核治疗或治疗超过1周、近12周内使用过免疫调节药物(免疫增强或抑制剂)、以及血液标本采集前有输全血或其他成分输血记录的患者均剔除本研究。

1.2 药品、试剂、仪器、给药方法

药品:胸腺肽-alpha1，商品名:日达仙，美国赛生药品股份公司生产，批号0292A，每支剂量规格为1.6 mg。试剂、仪器:检测仪器使用流式细胞分选仪，型号为 FACSCalibur，由美国Becton Dickinson(BD)公司生产，试剂盒由同一公司提供。离心机为法国JUNAN公司生产，型号为CR422。所有肠结核患者于治疗前1天(T0w)、治疗第16周结束(T16w)清晨抽取空腹静脉血3 ml，置EDTA抗凝管，高速离心取上清液，后置-800C中保存待测;T淋巴细胞亚群及 NK细胞检测使用FACSCalibur流式细胞仪及BD公司提供 perCP标记的抗CD3+、FITC标记的抗 CD4+、和 PE标记的抗 CD8+单克隆抗体进行染色，检测 CD3+、CD4+、CD8+细胞以及 NK细胞(CD16+CD56+)的百分数与CD4+/CD8+比值;流式细胞分选仪内部分析模块自动对结果进行定量分析。给药方法:所有患者根据各自病情先给予补液、纠正水及电解质酸碱平衡紊乱、胃肠减压、解痉、抗感染以及抗结核等基础治疗;抗结核治疗方案采用联合化疗，疗程为12个月，即前3个月采用异烟肼(INH 0.3 g，qd，po)、利福平(RFP 0.45 g，qd，po)、乙胺丁醇(EMB 0.75 g，qd，po)、吡嗪酰胺(PZA 1.0 g，qd，po)四联治疗，以后序贯9个月的等剂量 INH、RFP维持治疗;同时加强全胃肠外营养(total parenteral nutrition，TPN)治疗，采用葡萄糖、脂肪乳双重能量系统，每日提供168～210 kJ·kg-1。左右的热量，尽可能维持正氮平衡。同时给予胸腺肽 -alpha1皮下注射1.6 mg，每周2次，疗程总计使用16周。

1.3 药品不良反应观察

治疗期间，每次随访时均询问患者有无不适反应，包括局部刺激症状;并做常规体检;用药期间及用药结束3周后，观察患者血、尿常规，肝、肾功能的变化，如有异常则即给予对症处理。

1.4 基因组DNA提取

采集静脉全血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，常规蛋白酶K消化后苯酚/氯仿提取基因组DNA，总共提取肠结核患者外周血DNA 66例，提取的DNA溶解于 TE中，-80℃冰箱保存。

1.5 多态性位点的选择及引物设计

根据文献选择TNF-α基因启动子区的两个 SNP位点:-238G/A、-308G/A，每个多态性位点的详细资料见表1。在Gene Bank中检索到 TNF-α基因的全长序列，利用Generunner3.05(http://www.generunner.net/)软件，设计针对TNF-α中每个位点的 PCR扩增引物，引物由上海申友生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 TNF-α基因启动子区多态性位点的确认及引物设计Tab 1 Confirmation of TNF-α gene promoter polymorphisms and primer design

1.6 PCR反应体系及反应条件程序

PCR扩增体系及程序如下:ddH2O 40.5 μL，10×PCR缓冲液(含 1.5 mmol·L-1Mg2+)5 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，Taq 酶 5 U(Promega Company，USA)，上、下游引物各 1 μL(20 μmol·L-1)，DNA 模板 1 μL(500 ng)。PCR 扩增采用程序:94℃预变性2 min，94℃变性40 s→退火40 s，温度依次为59.0℃(TNFα -238)、52.5℃(TNFα -308)→72 ℃ 延伸 40 s，共30个循环，最后在72℃条件下延伸10 min(PE Biosystems，USA)，PCR产物采用 Multiscreen-PCR纯化板(Millipore Company，USA)进行纯化。

1.7 RFLP判断病例组TNF-α基因型

PCR产物经纯化后，分别采用限制性内切酶Msp I和Nco I(New England Biolabs Beverly，Ma，USA)对 TNF-α-238G/A、-308G/A两个位点进行酶切基因分型。每个反应体系为20 μL，其中 DNA 约 1 μg、内切酶 5 U、加各自内切酶相应的10 ×Buffer 2 μL、最后加 ddH2O 至 20 μL，在 37 ℃ 下水浴 8 h。酶切完成后进行琼脂糖(2%)电泳(Agarose-1000;Gibco BRL，Rockville，MD，USA)，根据电泳条带数判断每一个体TNF-α多态性位点的基因型。

1.8 统计学分析

以 Chi-square Test检验验证 TNF-α -238、-308基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律;采用两样本均数的t检验分析处理在不同多态性的情况下，T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化差异。所有统计检验均为双侧概率检验，P＜0.05表示具有统计学意义，统计学分析使用SPSS11.5软件。

2 结果

2.1 研究对象的基本资料

在本课题中肠结核患者的临床基线资料大致情况为:腹痛48例、腹泻34例、体重减轻29例以及发热14例;实验室检查的基线资料:贫血12例、白细胞计数增多19例、低蛋白血症3例、ESR(erythrocyte sedimentation rat)增高42例及 CRP(C-reactive protein)增高29例;肠结核病变侵犯部位统计:回盲部51例、升结肠29例、横结肠15例、降结肠5例、乙状结肠3例、直肠2例;出现肠腔狭窄:13例。

2.2 TNF-α启动子区基因多态性 PCR-RFLP电泳分析结果

66例肠结核患者中，TNF-α启动子中-238GG基因型为48例(72.73%)、-238GA基因型为 17例(25.76%)、-238AA基因型为1例(1.51%);TNF-α启动子中 -308G/G基因型为 51例(77.27%)、-308GA基因型为 15例(22.73%)，所研究患者中未发现 TNF-α启动子中 -308 AA突变纯合子个体。两个多态性位点的基因型，经检验P＞0.05，等位基因的频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.3 胸腺肽-alpha1治疗前后免疫学指标的比较

66例患者在常规抗结核治疗基础上加用胸腺肽-alpha1治疗后，统计结果显示(表2):在治疗16周结束时的统计分析结果显示:TNF-α-308 GA+AA基因型组合的患者中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK cells等检测值均较治疗前明显增高，均具有显著的统计学差异(P＜0.05);而TNF-α-308 GG野生型基因组合的患者在本实验的第16周观察终点，以上实验室检测值尽管略有不同，但统计分析结果显示无显著性差异(P＞0.05)。同样，TNF-α-238多态性位点野生型GG以及多态性GA的肠结核患者，在本实验的16周治疗终点的统计分析中，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK cells等检测值均未显示出统计学差异(P＞0.05)。

表2TNF-α基因多态性在胸腺肽-alpha1治疗前后免疫指标的比较(±s)Tab 2 Immune parameters of polymorphisms of TNF- α gene before and after the treatment with thymosin-alpha 1(±s)

表2TNF-α基因多态性在胸腺肽-alpha1治疗前后免疫指标的比较(±s)Tab 2 Immune parameters of polymorphisms of TNF- α gene before and after the treatment with thymosin-alpha 1(±s)

项目 变量 CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+ NK 24.50±3.13 T16w 59.05±9.54 52.16±8.35 27.54±6.59 1.78±0.14 24.15±4.46 P value 0.38 0.27 0.11 0.08 0.62 TNF-α-238 GA+AA T0w 57.05±7.28 56.92±7.22 26.26±4.85 1.66±0.56 28.66±5.16 T16w 58.58±7.03 55.85±9.36 27.05±5.32 1.72±0.48 27.90±4.86 P value 0.19 0.36 0.24 0.13 0.09 TNF-α-308 GG T0w 56.56±6.81 56.68±7.08 25.92±6.98 1.63±0.37 27.96±5.98 T16w 57.89±8.96 57.02±8.74 25.26±4.85 1.76±0.26 28.11±4.18 P value 0.71 0.56 0.90 0.06 0.45 TNF-α-308 GA+AA T0w 59.60±6.92 55.89±5.89 25.06±4.65 1.46±0.85 25.09±5.60 T16w 67.89±8.80 59.98±6.45 28.69±5.98 1.89±0.90 28.36±3.89 P细胞TNF-α-238 GG T0w 58.53±7.31 51.59±9.92 26.93±5.45 1.69±0.53 value ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.02 ＜0.01

2.4 不良反应

在本实验的66例患者中，有1例患者应用胸腺肽-alpha1治疗后躯干部出现散在的细小红色丘疹，给予抗过敏药物口服治疗后消失;有2例患者在应用胸腺肽 -alpha1治疗后其AST较治疗前有所增高，未超过2×ULN(upper limits of normal)，但不能排除为抗结核药物治疗所致，经保肝治疗后AST恢复正常。

3 讨论

TNF-α是由单核-巨噬细胞系统和内皮细胞分泌产生的具有多种生物活性的多肽调节因子，在机体的免疫调节中发挥着重要作用。通常在人体内，TNF-α是由处于静止状态下的巨噬细胞在内源性干扰素、细菌及其内毒素、病毒等刺激下被活化后产生的一种细胞因子，能够与白细胞介素-1等细胞因子相互诱生，从而激发炎症介质的级联反应。作为重要的内源性细胞因子，TNF-α具有广泛的生物学功能，适量浓度的TNF-α在体内具有抗感染免疫作用，有利于病原体及其产物的清除［3］。人类 TNF-α基因位于染色体6p21.3区域，在TNF-α启动子区域内，Kroeger等［4］研究了 TNF-α-308G/A多态性对TNF-α转录的影响，发现含有TNF-α A等位基因的重组体转录水平比含TNF-α G等位基因的重组体高两倍。另外，在关于TNF-α表达调控机制的研究中发现，一段长10 bp的含有TNF-α基因-308位点的DNA片段可能是转录因子AP-2的识别序列，当-308位点是G等位基因时，AP-2可以识别该序列并与之结合，若发生 G→A替换，AP-2无法识别该序列，因此TNF-α基因启动子区多态性可能通过影响其下游TNF-α的表达产量，与个体对感染性疾病的易感性、发展及预后相关［5］。

胸腺肽-alpha1是人胸腺素中纯化出来的一种生物因子，是由28个氨基酸组成的小分子多肽，具有促进体内细胞因子的分泌以及增强淋巴细胞功能的作用，也是一种细胞免疫增强剂［6］。在本试验中，66例肠结核患者在常规抗结核治疗基础上加用胸腺肽 -alpha1治疗后，统计结果显示在本实验第16周治疗结束时，TNF-α-308 GA+AA基因型组合的患者中 CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK cells等检测值均较治疗前明显增高，具有显著的统计学差异(P＜0.05);而TNF-α-308 GG野生型基因组合的患者以及 TNF-α-238多态性位点野生型GG、多态性GA的肠结核患者，尽管在本实验中的检测值略有不同，但统计分析结果显示无显著性差异(P＞0.05)。因此本实验结果表明TNF-α-308位点的基因多态性，可能与胸腺肽-alpha1治疗后机体T淋巴细胞的改变有着密切的关联;该结果提示我们在肠结核的治疗中，TNF-α-308位点的基因多态性对于肠结核患者的免疫辅助治疗，可能有着一定的筛选依据作用。

［1］ Karimi M，Goldie LC，Cruickshank MN，et al.A critical assessment of the factors affecting reporter gene assays for promoter SNP function:a reassessment of-308 TNF polymorphism function using a novel integrated reporter system［J］.Eur J Hum Genet，2009，17(11):1454.

［2］ Goldstein AL，GoldsteinAL.From labtobedside:emerging clinical applications of thymosin alpha 1［J］.Expert Opin Biol Ther，2009;9(5):593.

［3］ Wiedmann MW，Mössner J，Baerwald C，et al.TNF alpha inhibition as treatment modality for certain rheumatologic and gastrointestinal diseases［J］.Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2009，9(3):295.

［4］ Abraham LJ，Kroeger KM.Impact of the -308 TNF promoter polymorphism on the transcriptional regulation of the TNF gene:relevance to disease［J］.J Leukoc Biol，1999，66(4):562.

［5］ Sullivan DE，Ferris M，et al. TNF-alpha induces TGF-beta1 expression in lung fibroblasts at the transcriptional level via AP-1 activation［J］.J Cell Mol Med，2009，13(8B):1866.

［6］ Garaci E，Favalli C，Pica F，et al.Thymosin alpha 1:from bench to bedside［J］.Ann N Y Acad Sci，2007，1112:225.