雌激素对大鼠颅脑创伤后脑组织伤区 Bcl-2和 Bax表达的影响

霍龙伟 张建生 王小强 杨文征 姚焱鹏

雌激素对大鼠颅脑创伤后脑组织伤区 Bcl-2和 Bax表达的影响

霍龙伟 张建生 王小强 杨文征 姚焱鹏

目的 探讨雌激素是否通过影响大鼠颅脑创伤后脑组织伤区 Bcl-2和 Bax表达,起到脑保护作用。方法 采用改良的 Feeney自由落体脑损伤模型,将 60只 Wistar健康雄性大鼠随机分为治疗组、对照组和外伤组,治疗组的大鼠用苯甲酸雌二醇治疗。应用 HE染色检测脑组织和应用免疫组织化学方法检测伤区脑组织 Bcl-2及 Bax的表达变化,并且计算出 Bcl-2和 Bax表达的比值。结果 治疗组Bcl-2表达高于对照组和创伤组(P＜0.05),创伤组和对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。三组的 Bax表达相互比较差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗组 Bcl-2和 Bax表达的比值高于对照组和外伤组。结论 雌激素可能是通过促进 Bcl-2表达来减少颅脑损伤后神经细胞的凋亡,发挥脑保护作用。

颅脑创伤;雌激素;Bcl-2;Bax

越来越多的证据表明,性别差异对脑损伤预后有明显影响,并认为雌激素可能具有脑保护作用[1,2]。但是有关雌激素对脑保护研究主要在缺血性脑病方面,而与颅脑创伤(TBI)关系及其发生机制少有研究。本研究旨在通过研究大鼠 TBI后,雌激素是否影响伤区神经细胞 Bcl-2和Bax表达,从而了解雌激素对 TBI的保护作用,为防治 TBI提供新的希望。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 健康雄性Wistar大鼠 60只,体质量 265～310g(由甘肃省中医学院 SPF级动物实验中心提供,并在其内进行实验)。随机分为治疗组、对照组、外伤组,每组 20只大鼠。根据伤后处死时间点不同,将每组大鼠再分为 12、24、48、72h组,共 5个亚组,各个亚组动物 5只。治疗组:用改良 Feeney自由落体脑损伤装置致伤动物,并给予苯甲酸雌二醇(1mg/kg·d)腹腔注射治疗,于伤后立即治疗 1次,以后每天治疗 1次,直至动物处死;对照组:同法致伤动物,并给予等量生理盐水腹腔注射治疗;外伤组:同法致伤动物不予治疗。

1.2 试剂及仪器 苯甲酸雌二醇由广州白云山明兴制药有限公司提供;Bcl-2和 Bax试剂盒由美国 Bioworld Technology Inc公司提供;DAB显色盒和鼠抗兔 IG由博士德公司提供;显微镜 CX 31来源于 Olympus公司;显微处理系统来源山东易创;BZ-2000图像分析系统来源于成都泰盟。

1.3 模型制备 所有动物用 10%水合氯醛 350mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠,剪去大鼠头部毛发俯卧固定于实验台上,消毒,沿中线切开头皮约 2.0 cm,暴露顶部,于右侧中线旁 2 mm、冠状缝后 4mm处,牙科钻钻一直径约 5 mm骨窗,保持硬脑膜完整,按改良的Feeney法(击锤重 20 g,底面直径约 4 mm,30 cm高处自由落体)致大鼠右顶叶脑创伤模型,骨蜡封闭,缝合头皮后自由喂养。

1.4 标本采集 按照实验设计方案取不同的时间点的大鼠,经麻醉、开胸、经左心室插管、剪开右心耳、用生理盐水冲洗直至清亮、用 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注固定 60min后,取出大脑置于 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中再固定 24 h后,在脑组织损伤区做冠状切面,常规石蜡包埋、切片。

1.5 HE染色和Bcl-2和 Bax免疫组织化学方法 取各组石蜡切片行常规 HE染色和严格按照SP法行免疫组织化学,先进行脱蜡、水化、PBS洗 3次、抗原修复、PBS洗 3次、加封闭液、加Ⅰ抗、4℃过夜、PBS洗 3次、加Ⅱ抗、PBS洗 3次、DAB显色、苏木精复染 2m in、盐酸酒精分化、DAB溶液显色、自来水冲洗、脱水、透明、封片、镜检。镜下观察阳性细胞胞浆呈棕黄色。

1.6 结果观察 光镜下观察 HE切片和应用软件图像分析系统,在 400倍镜下计数 Bcl-2和Bax的阳性细胞率。计数方法:每张切片取8个高倍视野,每个视野计数阳性细胞所占的百分比,再取这 8个高倍视野阳性细胞所占的百分比平均值代表该张切片阳性细胞率,同法记数各时间点切片的阳性细胞数,总平均数代表该时间点的阳性细胞率,均以百分比表示。

1.7 统计学方法 实验中所得 Bcl-2和Bax数据用±s表示,用 SPSS 11.0统计软件进行成组设计 t检验,检验水准取双侧 α=0.05。Bcl-2阳性细胞率与 Bax阳性细胞率均数比值是通过均数比值计算公式得出。

2 结果

2.1 HE染色后在光镜下观察到 治疗组中神经细胞结构较清晰,未见明显的神经细胞核固缩、核碎裂、核染色质边集现象,排列分布均匀(图 1);对照组和外伤组中可见局灶性坏死,少量神经细胞肿胀,胞浆周围出现空晕,排列较松散,并伴有明显的神经细胞核固缩、核碎裂,凋亡细胞皱缩,胞浆嗜酸性增强,胞质致密,核染色质边集(图 2)。

2.2 Bcl-2阳性细胞主要位于损伤邻近区(图 3),远离损伤区可见少量阳性细胞(图4);Bc1-2阳性细胞染色位于细胞浆和(或)核周,为棕黄色;治疗组 Bcl-2阳性细胞百分比在伤后24 h达到高峰,随后逐渐下降;外伤组和对照组Bcl-2阳性细胞百分比在伤后 48 h达到高峰,随后逐渐下降;治疗组与外伤组、对照组各个时间点相比,Bcl-2阳性细胞百分比明显增高,具有统计学差异,而外伤组和对照组之间则无统计学差异(表 1)。

2.3 Bax阳性细胞同样为细胞浆着色位于细胞浆和(或)核周,为棕黄色,位于损伤邻近区(图 5);远离损伤区可见少量阳性细胞(图 6),各组Bax阳性细胞在伤后早 24h达到高峰,随后逐渐下降;各组的Bax阳性细胞百分比在各个时间点相互比较,无统计学差异(表 2)。

2.4 三组Bcl-2阳性细胞率与Bax阳性细胞率均数比值在同时间点相比较,治疗组的比值是最高的,并且在 24、48、72 h时间点比值超过 1.0,而对照组、外伤组均数比值最高值都没有超过 1.0(表 3)。

表 1 大鼠脑创伤后Bcl-2阳性细胞率变化(±s,%,n=5)

表 1 大鼠脑创伤后Bcl-2阳性细胞率变化(±s,%,n=5)

注:a治疗组分别与对照组和外伤组比较差异有统计学意义(P＜0.05);b对照组与外伤组比较差异无统计学意义(P＞0.05)

组别 12 h 24 h 48 h 72 h治疗组 24.94±0.78a 40.76±0.34a 38.71±0.25a 36.26±0.68a对照组 20.53±0.96b 25.23±0.19 b 34.42±0.54b 28.23±0.14b外伤组 20.79±0.52 24.98±0.43 33.86±0.87 28.12±0.23

表 2 大鼠脑创伤后Bax阳性细胞率变化(±s,%,n=5)

表 2 大鼠脑创伤后Bax阳性细胞率变化(±s,%,n=5)

注:a治疗组分别与对照组和外伤组差异无统计学意义(P＞0.05);b对照组与外伤组比较差异无统计学意义(P＞0.05)

组别 12 h 24 h 48 h 72 h治疗组 26.47±0.11a 39.61±0.50a 37.41±0.86a 32.67±0.56a对照组 27.43±0.87b 40.44±0.75b 37.86±0.62b 32.23±0.29b外伤组 26.99±0.62 39.54±0.91 38.21±0.33 32.43±0.81

表 3 大鼠脑创伤后Bcl-2阳性细胞率与Bax阳性细胞率均数比值变化

3 讨论

随着对脑损伤深入研究和分子生物学技术的发展,发现脑损伤后细胞凋亡对脑神经细胞有着重要的影响[3]。在细胞发生凋亡的机制中,Bax和Bcl-2是影响细胞凋亡重要因素之一。Bax表达可促进细胞凋亡,它主要通过自身两个 Bax形成同源二聚体并表达蛋白,其表达蛋白通过介导线粒体膜细胞色素 C得以穿过线粒体膜,并进一步激活caspase-9以及caspase-3,最终导致细胞凋亡[4]。Bcl-2表达则抑制细胞凋亡,它主要通过和Bax竞争性结合,形成更为稳定的异源二聚体,从而减少Bax形成同源二聚体,抑制Bax蛋白表达起抗凋亡作用[5]。因此Bcl-2/Bax比例也是决定细胞是否凋亡重要因素之一。正常情况下 Bcl-2/Bax比例保持着动态平衡,当在病理情况下,比值下降时,细胞就开始凋亡[6]。

雌激素是由雌激素合成酶催化雄激素转化而来的,其生理活性最强的是雌二醇。脑作为雌激素重要的靶器官之一,脑内很多核团能产生雌激素合成酶并表达雌激素受体,因此雌激素对脑的发育与脑功能发挥起着十分重要的调节作用[7]。本研究表明治疗组即雌激素组的 Bcl-2表达在伤后 24 h达高峰,48h和 72h逐渐下降。外伤组和对照组Bcl-2表达在伤后逐渐增高于 48h达高峰以后逐渐下降,并且高峰值低于同时间点治疗组峰值,而且下降速度快于治疗组。因此从本实验结果表明大鼠TBI后,雌激素可以上调抑制凋亡因子Bcl-2表达,这与国内外的一些研究结果相类似[8,9]。有学者研究认为雌激素可能通过激活 PI3-K-AKT信号途径激活,再激活第二信使环腺苷酸-蛋白激酶 A-环腺苷酸反应元件结合蛋白途径,进而上调 Bcl-2表达[10]。Bax表达在本实验中表达高峰发生在 24h,以后逐渐下降,并且治疗组、对照组和外伤组相互比较均无统计学差异。这表明雌激素对Bax表达可能不具有影响。但从各组 Bcl-2阳性细胞率与Bax阳性细胞率在各个时间点均数比值分析可以进一步表明雌激素抑制凋亡是通过提高 Bcl-2表达,进而提高 Bcl-2/Bax比值,减少 Bax形成同源二聚体,抑制神经细胞凋亡,从而减轻TBI对脑功能的损害。

本研究还发现大鼠颅脑创伤后,Bcl-2和Bax高表达发生在损伤邻近区而不是在损伤区和远离损伤区。这可能损伤区神经细胞已经坏死而无表达能力,远离损伤区低表达可能与该区受损程度轻有关。通过 HE染色观察发现,治疗组与对照组、外伤组相比较,神经细胞损伤明显减轻,这从另一方面提示雌激素可能通过抑制神经细胞凋亡,减轻神经细胞损伤,发挥脑保护作用。

总之,雌激素对TBI后脑保护机制非常复杂,并且有诸多争议[11]。本研究结果显示,雌激素可以通过上调Bcl-2的表达,减少神经细胞凋亡,但是有关雌激素对神经细胞凋亡调控机制还是有待于进一步研究。

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Effect of estrogen on the expressions of Bcl-2 and Bax genes of impaired brain tissue after traumatic head injury in rats

HUOLong-wei,ZHANG Jian-sheng,REN Hai-jun,etal.The Second Hospitalof Lanzhou University,Lanzhou730030,China

Objective To investigatewhether estrogen do have the brain protective function,by regulated the expression of Bcl-2 and Baxon the impaired brain tissueof ratswith traumatic head injury(TBI).Methods TBImodel was established according to Feeney'smethod.Sixtymale rats were divided into 3 groups,i.e.treatment group,controlgroup and wound group.Themale ratswere treatmentby injection ofestrogen in the treatment group.The brain tissuewas determined by Hematoxylin and eosin(HE)staining and image analysis.Expressionsof Bcl-2 and Bax in the brain tissuewere determined respectively by immunohistochemical technique in all the rats and Bcl-2 and Bax expression's ratio is calculated.Results The expression of Bcl-2 was significantly higher in the treatmentgroup than the control group and the wound group(P＜0.05).Therewas no significant difference between the expression of Bcl-2 in the controlgroup and thatof Bcl-2 in thewound group(P＞0.05).Therewere no significant differences in the expression of Bax among the three groups at every stage(P＞0.05).The expression's ratio of the treatment group's Bcl-2 and Bax is higher than that of the control group and thatof the wound group.Conclusion Estrogen can reduce theneuralapoptosis of impaired brain tissue after TBI in rats through promoting the expression of Bcl-2.

Traumatic head injury;Estrogen;Bcl-2;Bax

730030兰州大学第二医院神经外科

·临床案例·