猪圈及其周边社区环境大肠埃希菌气溶胶产生及其传播*

袁 文,柴同杰,周玉法,苗增民,张红双,秦 梅

(1.山东农业大学 动物科技与动物医学院,山东泰安 271018;2.泰安市岱岳区畜牧局,山东泰安 271000)

猪圈及其周边社区环境大肠埃希菌气溶胶产生及其传播*

袁 文1,柴同杰*,周玉法2,苗增民1,张红双1,秦 梅1

(1.山东农业大学 动物科技与动物医学院,山东泰安 271018;2.泰安市岱岳区畜牧局,山东泰安 271000)

目的是以大肠埃希菌为指示菌研究猪舍环境中微生物气溶胶产生及向其舍外环境的传播。采用Andersen-6级空气微生物样品收集器和RCS-离心式采样器分别在4个猪场舍内、舍外不同距离收集大肠埃希菌气溶胶,计算每个采样点大肠埃希菌的浓度;同时,采集猪的粪便,分离大肠埃希菌。利用ERICPCR技术,扩增其DNA条带,形成聚类图谱。通过每一个采样点大肠埃希菌遗传相似性分析及其浓度变化的比较,确认动物舍微生物气溶胶向舍外环境的传播模式。结果表明,4个猪场舍内空气中大肠埃希菌的浓度远远高于舍外大肠埃希菌浓度(P＜0.05)。52.4%粪便大肠埃希菌与舍内空气中的大肠埃希菌相似性可达90%以上;从猪场舍外下风方向分离到的多数大肠埃希菌(55%)与舍内空气或粪便中分离的大肠埃希菌相似性可达90%以上。说明源于猪舍的微生物气溶胶能够传播到舍外环境或居民社区,具有流行病学及公共卫生意义。

猪舍环境,大肠埃希菌气溶胶,ERIC-PCR,遗传相似性,流行病学及公共卫生意义。

动物舍环境中的微生物及其代谢产物形成的气溶胶不仅能够导致环境污染,影响动物的健康及生产能力[1],而且还能导致气源性传染病的流行。很多包括细菌和病毒在内的气载病原微生物都能够通过空气传播很远的距离,造成传染病的流行[2]。大量的事实表明[3-4],高致病性病原微生物以气溶胶的形式传染,提醒人们警惕气源性传染病。

为证明动物舍微生物气溶胶的来源及其向周围环境的扩散,过去曾经通过动物舍气溶胶浓度的变化[5]、在设计其周边环境中分离的细菌不同耐药性[6]等证明微生物气溶胶的发生与传播的。但是,用传统的细菌学方法很难区分遗传关系极为相近的菌株,其鉴别能力是有限的。为此,本试验测量了4个猪场舍内及舍外不同距离的大肠埃希菌含量,在细菌学鉴定的基础上,采用ERIC-PCR方法对不同地点分离的大肠埃希菌鉴定其同源性[7],获得大肠埃希菌ERIC片段指纹图谱,通过该片段在细菌基因组内的数量和分布之间的关系分析,比较其遗传相似性,获得其遗传距离,确认了其发生及其传播。

1 材料与方法

1.1 猪场情况

调查是从2008年3月到2009年2月在山东省枣庄市某猪场进行,采样猪舍(40 m×10 m×3.5m)均是机械通风的封闭舍,存栏育肥猪120头,每天进行1次粪便清理。采样时记录下当时的气象指标(表 1)。

表1 被调查的4个猪舍气象指标Tab le 1 Themeteorological index of four pig houses investigated

1.2 样本的采集与处理

1.2.1 空气样品的采集 舍内采用Andersen-6级撞击式微生物样品收集器,气流速度28.3 L/min,收集器设置于猪舍中央,高度为70 cm,根据不同卫生条件驱动时间在1 m in～5m in之间;舍外(上风向10、50m 和下风向 10、50、100、200、400m)同时采用2台 RCS-离心式采样器,采样高度距离地面约1.5m,气流速度为40 L/m in,根据距离的远近等因素收集时间在0.5 min～8 min之间,每个采样点收集7个样品,麦康凯培养基为采样介质。

1.2.2 空气样品的处理 将样品置于恒温箱37℃培养18 h～24 h后,把培养基上的所有菌落经过“KOH反应”试验鉴定其是革兰阴性菌还是革兰阳性菌。革兰阴性菌再在麦康凯培养基上进行一次纯分离培养,然后用API 20E鉴定。统计采样点大肠埃希菌的浓度(cfu/m3),并保存大肠埃希菌菌种。

1.2.3 粪便中大肠埃希菌的分离与鉴定保存 无菌收集新鲜的粪便样品(10份/舍),置于冰盒内冷藏运输,24 h内分离大肠埃希菌,并按照1.2.2方法鉴定保存。

1.3 模板的制备

用煮沸法制备大肠埃希菌模板,并在-20℃条件下保存备用。

1.4 ERIC-PCR

ERIC引物[8]由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ERIC-PCR反应体系 25μL:10×buffer 2.5μL,0.2 mmol dNTPs,0.5UTaqDNA聚合酶,0.2 mmo lM gCl2,400 pmo l/L ERIC引物,3μL模板DNA,最后用灭菌双蒸水补充至25μL。反应参数:95℃预变性7m in;94℃变性1m in,52℃退火1 min,68℃延伸 8 m in,共30个循环;最后65℃延伸10 m in结束反应。

PCR产物经12 g/L～15 g/L的琼脂糖凝胶电泳分离(1×TAE为电泳缓冲液,EB染色,3 V/cm条件下电泳1～1.5 h),电泳结果在紫外分析仪(Tanon-2500,Shanhai,China)上照相。

1.5 ERIC-PCR结果分析

计算机软件记录下扩增及电泳普带。利用NTSYS-pc 2.10软件构建聚类树状图。把每个分离株看作是一个分类学单位(OTU),并把相似性大于或等于90%的菌株看作起源相同的分离株[9]。

同一个猪舍内外环境和粪便中的大肠埃希菌均采用一个反应条件并同时一次完成,所有产物均使用同一块凝胶进行电泳,以便减少误差。

1.6 数据统计及分析

测得的大肠埃希菌浓度采用中间值表示,同时用最大值与最小值反映样品间数值的波动范围。所获得实验数据用Excel2003和Spss 11.5进行分析处理。

2 结果

2.1 舍内外不同距离空气中大肠埃希菌含量

4个猪场舍内测得的气载大肠埃希菌浓度分别为:35、23、27和 21 cfu/m3。4个猪舍外上风向 10、50m大肠埃希菌浓度分别为 A:4、2 cfu/m3;B:2、1 cfu/m3;C:3、2 cfu/m3;D:1、1 cfu/m3。下风向10m处大肠埃希菌浓度分别为18、18、14、9 cfu/m3;下风向50m 分别为7、3、8、4 cfu/m3;下风向100m 分别为3、2、1、2 cfu/m3;下风向 200m 分别为 1、2、1、1 cfu/m3;下风向400 m没有分离到。

A、B、C、D猪场舍内与舍外不同距离(上风向10、50 m 和下风向 10、50、100、200、400 m)大肠埃希菌浓度差异显著(P＜0.05);A、D猪场舍内与舍外上风向10、50m大肠埃希菌浓度差异显著(P＜0.05),但是A、B猪场舍外不同距离间(10～200 m)的大肠埃希菌浓度差异不显著(P＞0.05);下风向10、50 m处与上风向10、50 m处浓度差异显著(P＜ 0.05)(表 2)。

2.2 ERIC-PCR结果

用ERIC-PCR方法对分离的大肠埃希菌的DNA进行扩增,得到了每一个猪场舍内外不同环境中大肠埃希菌的遗传进化树状图(图1-4)。具有相同遗传进化关系的大肠埃希菌具有相同的ERICPCR指纹图谱[10]。

3 讨论

通过比较猪舍内外的气载大肠埃希菌的含量发现(表2),A、B、C和D舍内环境大肠埃希菌气溶胶浓度高于舍外上风方向到50m处(P＜0.05),也高于舍外下风方向不同距离其浓度(P＜0.05)。但是,猪场A和D舍内气载大肠埃希菌浓度与下风50m以内大肠埃希菌的浓度差异并不显著(P＞0.05)。显示了舍内微生物气溶胶借助舍内外气体交换,随着气流传播到舍外一定距离,50 m内受其影响较重。另外,比较4个猪舍外下风方向在50、100和200m之间大肠埃希菌的浓度差异不显著(P＞0.05),表明气载大肠埃希菌在一定的气象条件下可以传播到舍外下风较远的距离(≥200m)。在所有检测的猪舍下风400m处都没有检测到大肠埃希

菌,原因可能是受到风力因素的影响,大肠埃希菌含量较低;或者由于紫外线、氧气含量、各种各样的污染物以及温度、相对湿度等因素影响微生物在空气中的存活;或因较长时间的采样,应激因素对细菌的伤害导致部分细菌死亡,难以培养生长。

表2 4个猪场舍及其不同距离气载大肠埃希菌的浓度(cfu/m空气)(n=7)Table 2 The con cen tration of E.coli at different distan ce of the four pig houses(n=7)

图1 猪舍A中,从不同采样点分离的大肠杆菌遗传关系聚类树状图Fig.1 The genetic relationship dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm A

图2 猪舍B中,从不同采样点分离的大肠埃希菌 遗传关系聚类树状图 Fig.2 The genetic relationsh ip dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm B

图3 猪舍C中,从不同采样点分离的大肠杆菌遗传关系聚类树状图Fig.3 The genetic relationship dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm C

图4 猪舍D中,从不同采样点分离的大肠埃希菌 遗传关系聚类树状图 Fig.4 The genetic relationsh ip dendrogram of E.coli isolated at the different distance of pig farm D

ERIC-PCR技术是利用ERIC核心的高度保守反向重复序列设计引物进行PCR,作为一种准确可靠的分子鉴定技术,用于细菌病原学和分子流行性病学研究[9]。本试验中,ERIC-PCR扩增产物电泳图象经过软件分析自动生成了矩阵图,并利用NTSYS-pc 2.10软件构建了聚类树状图,经过分析,获得不同菌株之间的相似性。这种方法能够有效地鉴定从同一猪舍不同采样点采集到的大肠埃希菌之间的遗传距离及其相似性。ERIC-PCR结果表明(图1-4),52.4%粪便大肠埃希菌(4个猪舍分别为:2/4,50%;2/4,50%;3/6,50%;4/7,57.1%)与舍内空气中的大肠埃希菌相似性可达90%以上,表明舍内空气中的这些大肠埃希菌是由粪便中的同一菌株繁殖而来,来源相同。也就是说,粪便中的大肠埃希菌可以形成气溶胶,污染舍内空气。

从猪场舍外下风方向10、50、100、200 m 分离到的多数大肠埃希菌(55%,23/42)与舍内空气或粪便中分离的大肠埃希菌相似性可达90%以上,如猪舍A中Downw ind10m-2与Feces-2;Downw ind50m-1与Feces-1、Indoor-4的相似性为100%等。表明粪便中或舍内空气中的大肠埃希菌可以通过舍内外气体交换传播到舍外。

而从猪舍上风分离到的大肠埃希菌与舍内空气或粪便中的大肠埃希菌相似性较小,在66%～89%之间。表明从上风方向分离到的这些大肠埃希菌与舍内动物粪便或舍内空气中的遗传距离差别较大,有其它来源。

通过以上结果看出,ERIC-PCR对细菌鉴定的准确性和可靠性。在所测量的4个猪场舍内,猪的粪便中的大肠埃希菌能够经过一定的理化过程形成气溶胶,进入气悬状态,对本猪群或饲养人员的健康形成威胁。而且,他们能够随着舍内外气体的交换传播到周围环境或社区,对牧场周边环境造成生物污染,或造成病原体的扩散,致使传染病的流行。以大肠埃希菌作为一种指示菌来研究动物舍中微生物气溶胶向周围环境的传播,具有兽医公共卫生学和流行病学意义。

致谢:本研究获得中国国际合作项目“动物疫源性人畜共患病病原体气溶胶的监测”[2009DFA32890]。

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ERIC-PCR Identification of the Formation and Sp reading ofEscherichia coliAerosols in Pig Houses

YUANWen1,CHAI Tong-jie*1,ZHOU Yu-fa2,M IAO Zeng-m in1,ZHANG Hong-shuang1,Q IN M ei1

(1.College of Animal Science,Shandong Ag ricultural University,Tai’an,Shandong,271018,Ch ina;2.Farm ing Bureau of Daiyue District in Taian City,Tai’an,Shandong,271000,China)

In order to have a full understanding of the form ation ofm icrobial aerosols in pig houses and of their spreading to surroundings,w ithEscherichia coli(E.coli)as the indicator bacterium.we collected theE.coliaerosols from 4 pig housesand their surroundings at different points,and calculated the concentration ofE.coliat each sam pling point.A t the sam e time,we collected the feces of pigs to separateE.coli.By the app lication of ERIC-PCR technology,we aimed to estab lish a cluster spectrum by w idening the DNA band ofE.coliisolates collected from different sam pling points.By analyzing the genetic sim ilarity ofE.coliiso lates and comparing the concentration change ofE.coli,weattem pted tom ake clear how m icrob-i al aerosols are formed in pig houses and spread to thesurroundings.The results showed that concentrations of airborneE.coliin the 4 pig houses were much higher than thosemeasured outdoor(P＜0.05).The ERIC-PCR resu lts also showed that52.4%of the fecalE.coliw ere identical to the indoor airborneE.coli-i solates,and there was more than 90%similarity between the majority ofE.coli(55%)isolated from downw ind air and those from indoor air or feces.The aerosols formed in a pig house can spread to the surroundings and to residential areas,and thus this study is of epidem io logical and pub lic health significance.

pig house;airborneEscherichia coli;ERIC-PCR;sim ilarity;epidem iological and public health significance

S851.24

A

1007-5038(2010)04-0027-05

2010-03-24

袁 文(1982-),女,山东济南人,研究方向为动物微生物学。*通讯作者