铁皮石斛腋芽的快速繁殖

何 涛,淳 泽,汪天杰,郑若劫

(中国科学院成都生物研究所,四川成都 610041)

铁皮石斛 (Dendrobium officinale Kimura et Migo)既是传统名贵中药,又是国家保护植物。为了做到保护与开发并举,通常利用组织培养的方法快速繁殖获得种苗,为人工栽培提供种源。在前人对铁皮石斛快速繁殖的报道中,多集中以种子、茎尖、茎段等为外植体,并通过原球茎的增殖与分化来繁殖种苗[1-7]。其中存在的问题是用种子繁殖的后代有可能产生变异;茎尖作为外植体会散失母株,茎段由于自身带菌严重,会消毒不彻底。并有研究表明[8]由于石斛的特殊性,在石斛的组织培养中,外植体的选择是十分关键的因素,不同的取材部位和时期,培养的结果也不一样,并且其他外植体形成的试管苗比种子试管苗成株快,茎粗,苗壮,易成活。而直接取材于腋芽作为外植体,不仅取材更方便,并且不伤母株的茎,能保留茎的完整性。目前对铁皮石斛腋芽直接培养诱导成苗的研究还未见报道。本试验拟直接取材于铁皮石斛的腋芽作为外植体,直接诱导丛芽,比较不同种类、浓度的激素组合和不同的天然提取物对腋芽的存活生长、丛芽的诱导增殖以及成苗的影响,研究和探索丛生芽途径成苗的数量以及质量,筛选各时期的最佳培养基配方,从而建立丛生芽途径的高效快速繁殖体系,使通过快速繁殖获得的植株能与母株保持遗传上的一致性,为铁皮石斛野生居群的恢复提供材料,达到保护野生资源的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料铁皮石斛 (D.officinale)采自贵州荔波、三都,广西乐业、永福,种植于本所苗圃。

1.2 方法

当铁皮石斛植株茎节间新长出腋芽长 0.5～1.0 cm时,用刀片小心切下完整腋芽,自来水冲洗干净。在超净工作台上,材料先用 75%酒精浸泡30 s后,0.1%升汞消毒 10 min,无菌蒸馏水浸洗 4次,每次 5 min。多余水分用无菌滤纸吸干。最后将材料接种在试验培养基上。

以MS为基本培养基,分别添加不同种类和浓度的NAA、BA以及不同的天然提取物香蕉汁 100 g/L或马铃薯 200 g/L,蔗糖 3%,琼脂 7 g/L,pH 5.8～6.0,高压灭菌 20～25 min。培养室温度 (26±2)℃,以日光灯为光源,光照强度 2000 lx,每天光照12 h。

材料接种培养后,随时观察腋芽的成活生长、丛生芽的诱导增殖以及试管苗的健壮情况,并定期统计腋芽成活率、丛生芽的诱导增殖倍数和丛芽个数,同时对出瓶试管苗的茎粗、茎高、叶片数、叶色以及根数等形态学特征进行了调查。

2 结 果

2.1 不同激素组合对腋芽成活生长的影响

基本培养基为 1/2MS,将添加不同种类和浓度的NAA、BA对腋芽的成活生长情况列于表1中。由表1可见,当培养基中没有添加任何激素时,培养60天后,有 50%的腋芽仍保持成活,但基本维持原来状态,没有进一步的生长。而有 50%的腋芽会逐渐变黄褐化而死亡。培养基中添加激素后,腋芽开始伸长生长,并分化出叶。只是激素比例不同,腋芽萌发生长的时间、存活率有所差异。如果只添加NAA,腋芽成活率只有 33.3%。当 NAA和 BA浓度相同或大于 BA时,腋芽最长 0.5 cm,成活率分别为42.5%和 50%。当 BA浓度大于 NAA时,腋芽萌动时间最早,培养 10天就可见腋芽变粗、伸长,60天后,长度可达 1.5～1.8 cm,长出 3片叶,并且成活率为 100%。以上结果表明,最适合石斛腋芽接种后成活生长的培养基为:1/2MS+NAA 0.2 mg/L+BA 1 mg/L。

表1 不同激素组合对腋芽成活生长的影响

2.2 不同 BA与香蕉汁组合对丛生芽诱导增殖的作用

在腋芽继续伸长生长的同时,其基部不断有新的丛生芽发生。表2列出了培养基中添加天然提取物香蕉汁和不同浓度的细胞分裂素BA对丛生芽诱导增殖的影响。由表2可见,加入香蕉汁后发生丛生芽的时间提前,并能提高芽的增殖倍数,有利于铁皮石斛丛生芽的诱导与增殖。在生长素 NAA浓度相同 (0.5 mg/L)的情况下,随着 BA浓度的不断增加,增殖倍数不断提高,当 BA浓度为 2.0 mg/L时,培养 160 d,增殖倍数达最大值 14.0,平均增殖倍数也是最高的,为 6.4,1个腋芽能增殖的最多丛芽数高达 111个。但 BA浓度超过 2.0 mg/L,为 5.0 mg/L时,增殖倍数又呈下降趋势。本试验表明NAA和 BA适当组合能较大程度的提高增殖倍数,促进丛生芽的诱导与增殖。其最适培养基为 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+BA 2.0 mg/L+香蕉汁 100 g/L。从表2还可以看出,随着培养时间的延长,增殖倍数也呈逐渐提高趋势。

表2 不同 BA与香蕉汁组合对丛生芽诱导增殖的作用

2.3 天然提取物对丛生芽生长成苗的影响

丛生芽转到新的培养基中,经过 2～3个月的壮苗培养,形成试管苗。表3表明,当培养基中没有添加任何天然提取物时,丛生芽长成的试管苗纤细、矮小,叶色淡绿,叶片数少,每苗根数较少。只有13.2%的试管苗达到优质苗的标准。当培养基中添加了香蕉汁或马铃薯汁时,试管苗的质量得到明显改善,90%以上的试管苗为优质苗。茎高为 6～14 cm,茎粗为 0.2～0.4 cm,叶色浓绿或淡绿,叶片数增加到 5～9片,每株苗根数增多为 5～9条。本试验表明天然提取物香蕉汁或马铃薯汁均有利于壮苗、生根。

表3 天然提取物对丛生芽生长成苗的影响

3 讨 论

曾有报道 NAA与 BA适当配合可促进石斛丛生芽的诱导与增殖[9]。本试验结果也证实了这一点,只是最佳比例组合有所不同,前人报道的最适组合为 NAA 1 mg/L,BA 3 mg/L。我们试验的铁皮石斛丛生芽诱导与增殖的最佳比例为NAA 0.5 mg/L,BA 2.0 mg/L,这可能与培养的石斛种类不同有关。另有研究表明[10],在培养基中添加天然提取物椰子汁有利于丛芽的增殖,我们实验也表明当添加另外的天然提取物香蕉汁也同样有利于丛芽的增殖。

本试验还特别对试管苗的根、茎、叶等形态学特征进行了调查,并与生产中铁皮石斛种苗的等级进行了比较,发现培养基中添加天然提取物香蕉汁或马铃薯汁均能获得优质苗。优质苗的获得为成功移栽奠定了材料基础。

同时,通过丛生芽途径建立的快繁体系,也使铁皮石斛优质试管苗的数量得到极大提高,在合适的培养基上,丛生芽诱导的最大增殖倍数可达 14.0。以平均增殖倍数 6.4计算,如果 1个芽 1年继代培养 5次,可获得 6.45=10737.4个芽,培养 100个腋芽就可以获得 100万个左右的丛生芽,进而可获得100万丛试管苗。与分株繁殖相比,大大提高了繁殖系数。

濒危植物铁皮石斛高效快繁体系的建立为规模化生产提供了技术上的可能性。其深远意义不仅仅是规模化生产的种苗依靠人工栽培来满足市场需求,产生经济效益,并且规模繁殖成功还可以增加野生居群数量,有利于野生居群的恢复,产生良好的社会效益和生态效益。

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