抗氧化肉品发酵剂乳酸菌的筛选及特性*

刘书亮，王燚，叶劲松，杨勇，陈荀，廖哲

1(四川农业大学食品学院，四川 雅安，625014) 2(四川北牧南江黄羊集团有限公司，四川 南江县，636600)

肉品发酵剂中优势菌群——乳酸菌的存在，保障了发酵肉制品的食用安全性，而葡萄球菌对产品的最终颜色和风味形成起到较大的作用［1］。为了获得优良的菌种作为肉品发酵剂，国内外学者进行了较多的研究。Miralles［2］、Aymerich［3］等对西班牙发酵香肠，Coppola R［4］、Parente［5］等对意大利传统发酵香肠，Papamanoli［6］对希腊自然发酵香肠，Fontana［7］对阿根廷发酵干香肠等进行了香肠菌相研究并获得一些肉品发酵剂菌种。近年来，国内较多研究者对我国传统发酵肉制品菌相进行初步研究和(/或)获得了肉品发酵剂的一些候选菌株［8－12］。最近，有报道显示，某些乳酸菌具有一定抗氧化活性［13－16］。腌腊肉制品的氧化酸败是其变质的主要原因之一，添加抗氧化剂可一定程度地抑制肉制品的脂肪氧化［17］。若能获得具有抗氧化能力的肉品发酵剂乳酸菌将是解决肉品氧化变质的另一条有效途径，但目前关于抗氧化肉品发酵剂乳酸菌的筛选尚鲜见报道。本实验以四川传统腌腊肉制品中的乳酸菌为筛选菌源，按照肉品发酵剂要求初筛，再以其抗氧化能力为复筛指标，获得具有较强抗氧化能力的菌株，研究其生物学特性和进行菌种鉴定，为功能性肉品发酵剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

乳酸菌58株，分离于四川传统腌腊肉制品;木糖葡萄球菌S02(Staphylococcus xylosus S02)分离于四川腊肉，由四川农业大学食品学院食品微生物实验室保存。

1.1.2 培养基

改良MRS固体(液体)、MSA、MSM培养基，系列筛选培养基(耐盐、耐亚硝酸盐、氨基酸脱羧酶、硝酸盐还原、产氨、产H2S和产气等试验);各种生化鉴定培养基(各种糖(醇)类发酵培养基，七叶灵水解、淀粉水解、甲基红(M.R)、V-P、吲哚和明胶液化等试验的培养基)［18］。

1.1.3 主要药品试剂

2× long Taq PCR MasterMix、DNA MakerⅢ购自北京天为时代科技有限公司;Bacterial DNA out抽提试剂盒购自四川绵阳天泽基因工程有限公司;16S rDNA的 PCR扩增引物(上游引物3'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5';下游引物 3'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-5')由上海 invitrogen公司合成;二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)购自Sigma公司;其他试剂均为分析纯。

1.1.4 实验动物

昆明种小白鼠及饲料购自四川简阳简城比尔动物养殖场，合格证号:SCXC(川)2004－15。

1.2 方法

1.2.1 肉品发酵剂乳酸菌初筛

将待测乳酸菌进行耐盐、耐亚硝酸盐、接触酶、氨基酸脱羧酶、硝酸盐还原酶、产氨、产H2S、产气和产黏液试验［18］，确定是否符合肉品发酵剂的要求。

1.2.2 抗氧化肉品发酵剂乳酸菌复筛

1.2.2.1 乳酸菌清除羟自由基(·OH)的测定

按照张江巍［19］的方法制备乳酸菌无细胞提取物;按照刘骏［20］的方法测定乳酸菌发酵上清液和无细胞提取物对·OH的清除率。

1.2.2.2 乳酸菌清除DPPH·的测定

参照 Singh［21］、Lin［16］等方法(略有改进)。取样液0.3 mL于比色管中，加入无水乙醇至3 mL，再加入0.1 mmol/L DPPH·试剂1 mL，强烈振荡后避光室温静止30min，以溶剂调0点，用1 mL比色皿于517 nm处分别测定各反应液的吸光值Ai。同时，测定溶剂和DPPH·试剂的吸光度Ac，样液和溶剂的吸光度Aj。平行测定3次。按下式计算:

1.2.3 抗氧化乳酸菌菌株的生物学特性

1.2.3.1 菌株生长曲线的测定

将筛选出的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，30℃培养72 h，每隔2 h测定其OD600和pH值。同时以空白MRS作对照。

1.2.3.2 菌株在不同温度下的生长情况

1.2.3.3 菌株间的拮抗试验

将乳酸菌LS85对木糖葡萄球菌S02做拮抗试验。按接种量1%(菌液浓度为1.5×107CFU/mL)接种于MSM培养基中，30℃混合培养72 h，每12 h测定pH值及乳酸菌数和葡萄球菌数。乳酸菌数和葡萄球菌数分别采用改良MRS和MSA选择性培养基进行稀释平板计数法测定。

1.2.3.4 菌株活菌液的急性毒性试验

乳酸菌LS85的24 h培养液经5 000 r/min离心20 min，收集菌体，用无菌生理盐水调节菌数至1.5×108CFU/mL。取昆明种小白鼠20只，按照随机分组原则分为2组，每组10只，雌雄各半。试验组按0.2 mL/10 g BW，将乳酸菌LS85的活菌液经口灌胃给小鼠;对照组给予相同剂量生理盐水。实验前禁食过夜，但保证正常饮水。灌胃后恢复正常饮食。试验期限为15 d。每天观察记录小鼠饮水、进食、活动及死亡情况。

1.2.4 菌株的鉴定

参照文献［18］，通过形态学、生化指标及分子遗传学(16S rDNA)鉴定LS85菌株，确定其种属分类地位。

2 结果与分析

2.1 肉品发酵剂乳酸菌的初筛情况

按照肉品发酵剂筛选标准，源于四川传统腌腊肉制品中的58株乳酸菌的初筛结果表明，符合耐6%食盐、耐100 mg/L亚硝盐以及接触酶、氨基酸脱羧酶、硝酸盐还原酶、产氨、产H2S、产气和产黏液试验均为阴性的菌株仅有8株，符合率为13.8%(8/58)。

2.2 抗氧化肉品发酵剂乳酸菌的复筛情况

先后以清除·OH能力和DPPH·为抗氧化能力的筛选指标对符合肉品发酵剂筛选标准的8株乳酸菌进行了复筛。8株乳酸菌发酵上清液和胞内提取物对·OH的清除能力(见图1)。

图1 乳酸菌对·OH的清除能力

由图1知，乳酸菌LS85发酵上清液对·OH的清除能力最强，而乳酸菌S21－4胞内提取物对·OH的清除能力最强。除C21－5和C21－7外，其余菌株发酵上清液和胞内提取物对·OH清除能力的差异不明显。

2013年，水文局认真学习贯彻党的十八大及十八届三中全会精神，扎实开展党的群众路线教育实践活动，紧密围绕水利中心工作，积极践行“大水文”发展理念，切实推进水文行业管理和各项业务工作，特别是在做好服务防汛抗旱减灾和水资源管理等方面取得了一些成效，主要包括以下几个方面：

选取LS85和S21－4进行了DPPH·清除率的测定，结果见图2。

图2 乳酸菌对DPPH·的清除能力

由图2可知，LS85发酵上清液对DPPH·清除率明显高于S21－4，二者的无细胞提取物对DPPH·清除率无明显差异。综合考虑其抗氧化的能力，最后选择LS85菌株进行生物学特性研究。

2.3 抗氧化乳酸菌菌株LS85的生物学特性

2.3.1 菌株LS85的生长曲线

乳酸菌LS85培养72 h的生长曲线和pH值变化情况见图3。由图3可知，乳酸菌LS85在0～2 h为迟缓期，从第2 h起进入对数期生长，在第32 h时菌体密度达到最大值，此后菌株生长进入稳定期，其培养液pH值在24 h内由pH6.58降至pH3.88，以后进入动态平衡。

图3 乳酸菌LS85培养72h的生长曲线和pH值变化

图4 乳酸菌LS85在不同温度下的生长情况

2.3.2 菌株LS85在不同温度下的生长情况

菌株LS85在不同温度下的生长情况见图4。由图4知，该菌能在15～40℃内生长，只是在15℃和20℃时，生长缓慢，而在 25、30、35、40℃ 下生长速度较快，差异不明显。具有较宽的生长温度范围。

2.3.3 菌株间的拮抗试验

乳酸菌LS85与木糖葡萄球菌S02的拮抗试验结果见图5。由图5可知，LS85+S02组可以共同生长，相互间没有影响，即无拮抗作用。

图5 乳酸菌LS85和葡萄球菌S02在模拟肉汤中混合培养时的相互关系

2.3.4 菌株LS85活菌液的急性毒性试验

以小白鼠为试验对象，对乳酸菌LS85的活菌液进行的急性毒性试验表明，在15 d饲喂期内，试验组和对照组小白鼠生长良好，进食正常，未见中毒死亡，解剖未见异常。雌、雄小鼠经口LD50均大于15 000 mg/kgBW。根据GB15193.3－1994《食品安全性毒理学评价程序和方法》中急性毒性的分级标准，乳酸菌LS85的活菌液属于实际无毒。

2.4 乳酸菌LS85的系统鉴定

2.4.1 乳酸菌LS85的形态学特征

乳酸菌LS85在MRS平板上的菌落特征:直径约1.5 mm、圆形、凸起度中等、边缘整齐、表面光滑、乳白色、不透明。革兰氏染色镜检观察为G+杆菌，短链或成排排列，大小为(1.1～1.2)μm×(2.0～2.3)μm，无芽孢、无鞭毛，无荚膜。

2.4.2 乳酸菌LS85的生化鉴定

乳酸菌LS85的生化鉴定结果见表1。由于其接触酶阴性，发酵葡萄糖产酸，无运动性，不产 H2S，15℃能生长，确定为乳杆菌属(Lactobacillus)。结合形态学指标，由表1可知，对照文献［18］，初步将菌株鉴定为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus LS85)。

表1 乳杆菌LS85的生化鉴定结果

2.4.3 乳酸菌LS85的分子遗传学鉴定

以乳酸菌LS85的总DNA为模板，采用通用引物进行扩增，得到一条长度约1.5kb的特异性扩增产物。并将PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序，测序片断长1450bp，具有典型的16S rDNA的特征。该序列在GenBank上的登陆号为EU693522。经http://www.ncbi.nlm.nlh.gov网站中使用 BLASTN 2.2.15在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因库中进行同源性搜索，比对结果表明乳酸菌LS85与登录号EU483102.1、EU483101.1、AB362758.1 等10株戊糖乳杆菌的同源性为100%。结合形态、生化鉴定及16S rDNA比对结果表明乳酸菌LS85为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosusLS85)。

3 讨论

3.1 肉品发酵剂乳酸菌的筛选

目前，国内外对肉品发酵剂乳酸菌筛选的报道很多，但多为直接将已知菌种按照筛选标准进行筛选。从传统发酵肉制品中分离乳酸菌菌株，再按照肉品发酵剂筛选标准进行筛选与鉴定的报道较少。Papamanoli［6］、Fontana［7］、Aymerich［3］、Drosinos［22］从发酵香肠中分离出清酒乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、干酪乳杆菌(L.pentosus)、弯曲乳杆菌(L.pentosus)、植物乳杆菌(L.pentosus)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)等优势乳酸菌。国内一些学者［8－12］从自然发酵肉制品中分离鉴定出清酒乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌(L.pentosus)、干酪乳杆菌、食品乳杆菌(L.pentosus)等［8－12］，适宜作肉品发酵剂。本文从四川传统腌腊肉制品中的58株乳酸菌初步筛选出8株适宜为肉品发酵剂菌株，再以清除·OH和DPPH·的能力复筛，得到1株具有抗氧化能力的戊糖乳杆菌。该菌株生长温度范围较广，对木糖葡萄球菌没有拮抗作用，小鼠急性毒性试验表明其为实际无毒，可用于功能性肉品发酵剂的开发。

3.2 乳酸菌的抗氧化能力

目前国外对乳酸菌抗氧化能力的研究较多。如Lee等［13］报道了干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)具有螯合金属离子效应、Lin等［16］报道了嗜酸乳杆菌(L.acidophfilus)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)具有抗脂质过氧化和消除·OH的能力。而国内张江巍等分别探讨了乳酸菌［19］和发酵乳［15］抗氧化能力;张凤敏等［23］筛选到具有抗氧化能力的植物乳杆菌;张书文等［24］研究了2株乳酸菌对活性氧的耐受性。本试验对8株乳酸菌消除·OH能力的结果表明所有的乳酸菌都具有一定的抗氧化能力，与文献［19］报道的结果相一致，最终筛选到1株具有较强抗氧化能力的戊糖乳杆菌(L.pentosus)。其发酵上清液和胞内提取物对·OH的清除率分别为88.67%和75.6%;对DPPH·的清除率分别为46.3%和28.6%。目前具有抗氧化能力的乳酸菌主要有:嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、清酒乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌等［13－16］，但还没有关于从传统肉制品中筛选到具有较强抗氧化能力的戊糖乳杆菌的报道，这对功能性肉品发酵剂的研发具有重要的理论意义与应用价值。

4 结论

本文通过待测乳酸菌的耐盐、耐亚硝酸盐、接触酶、氨基酸脱羧酶、硝酸盐还原酶、产氨、产H2S、产气和产粘液试验等指标符合肉品发酵剂标准后，再以对·OH、DPPH·清除率为抗氧化指标，并对筛得的菌株进行急性毒性试验评价和细菌学系统鉴定，获得了1株安全而有抗氧化性能的肉品发酵剂戊糖乳杆菌。研究结果对于改进发酵肉制品的品质和安全性具有重要意义。

［1］ Hugas M，Monfort J M.Bacterial starter cultures for meat fermentation［J］.Food Chemistry，1997，59(4):547 －554.

［2］ Miralles M C，Flores J，Perez Martinez G.Biochemical tests for the selection ofStaphylococcusstrains as potential meat starter cultures［J］.Food Microbiology，1996，13(3):227－236.

［3］ Aymerich T，Martin B，Garriga M，et al.Safety properties and molecular strain typing of lactic acid bacteria from slightly fermented sausages［J］.Journal of Applied Microbiology，2006，100(1):43 －49.

［4］ Coppola R，Giagnaeovo B，Iorizzo M，et a1.Characterization of lactobacilli involved in the ripening of soppressata molisana，a typical southern Italy fermented sausage［J］.Food Microbiology，1998，15(3):347 －353.

［5］ Parente E，Grieco S，Crudele M A ，et al.Phenotypic diversity of lactic acid bacteria isolated from fermented sausages produced in Basilicata(Southern Italy) ［J］.Journal of Applied Microbiology，2001，90(6):943－952.

［6］ Papamanoli E，Tzanetakis N，Litopoulou.Tzanetaki E，et al.Characterization of lactic acid bacteria isolated from a Greek dry-fermented sausage in respect of their technological and probiotic properties［J］.Meat Science，2003，65(2):859－867.

［7］ Fontana C，Cocconcelli P S，Vignolo G.Monitoring the bacterial population dynamics during fermentation of artisanal Argentinean sausages［J］.International Journal of Food Microbiology，2005，103(2):131 －142.

［8］ 罗欣，王海燕，张春江，等.发酵香肠中的菌种分离及鉴定［J］.食品与发酵工业，2003，29(3):5－9.

［9］ 吕兵，张国农.分离自传统腊肠中的乳酸菌的特性研究［J］.食品与发酵工业，2004，30(8):64 －67.

［10］ 王永霞，牛天贵，郝华昆.肉品发酵剂葡萄球菌和微球菌的筛选［J］.食品与发酵工业，2004，30(9):5－10.

［11］ 李宗军.中国传统酸肉中葡萄球菌的分离鉴定与应用研究［J］.生物技术通报，2006，3:77－80.

［12］ 刘书亮，敖灵，李燮昕，等.传统腌腊肉制品中乳酸菌的分离和鉴定［J］.食品与机械，2007，23(5):14－16.

［13］ Lee J，Hwang K，Chung M Y，et al.Resistance of Lactobacillus casei KCTC 3260 to reactive oxygen species(ROS):Role for a metal ion chelating effect［J］.Journal of Food Science，2005，70(8):388 －391.

［14］ Lin M Y ，C L Yen.Reactive oxygen species and lipid peroxidation product scavenging ability of yogurt organism［J］.Journal of Dairy Science，1999，82(8):1 629 －1 634.

［15］ 张江巍，曹郁生，刘晓华，等.抗氧化乳酸菌L4的SOD活性及其发酵乳的抗氧化作用［J］.中国乳品工业，2006，34(11):12－15.

［16］ Lin M Y，Chang F Y.Antioxidative efect of intestinal bacteria Bifidobacterium longum ATCC 15708 and Lactobacillus acidophilus ATCC4356［J］.Digestive Diseases and Sciences，2000，45(8):1617 －1622.

［17］ Renata T N，Lireny A G G，Maria Aparecida A P D S，et al.Oxidative stability of fermented goat meat sausage with different levels of natural antioxidant［J］.Meat Science，2003，63(1):43－49.

［18］ 凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及试验方法［M］.北京:中国轻工业出版社，1999

［19］ 张江巍，曹郁生，李海星，等.乳酸菌抗氧化活性及检测方法［J］.中国乳品工业，2005，33(9):53－56.

［20］ 刘骏.结晶紫分光光度法测定Fenton反应产生的羟自由基［J］.武汉工业学院学报，2005，24(2):53－55.

［21］ Singh R P，Chidambara Murthy K N，Jayap rkasha G K.Studies on the antioxidant activity of pomegranate peel and seed extracts using in vitro models［J］.Journal of Agricultural＆ Food Chemistry，2002，50(1):81 －86.

［22］ Drosinos E H，Mataragas M，Xiraphi N，et al.Characterization of the microbial flora from a traditional Greek fermented sausage［J］.Meat Science，2005，69(2):310－312.

［23］ 张凤敏，田丰伟，陈卫等.具抗氧化活性乳酸菌的筛选［J］.中国乳品工业，2007，35(2):4－7.

［24］ 张书文，吕加平，孟和毕力格，等.两株乳酸杆菌 SY13和LJJ对活性氧的耐受性［J］.微生物学报，2009，49(2):119－124.