超速驱动诱发大鼠离体心脏心肌顿抑的研究

李新建,张钢林,邢少东,苏全生,赵广高

(1.北京体育大学附属医院,北京 100084;2.成都体育学院,四川 成都610041;3.江西南昌大学,江西 南昌 330031)

超速驱动诱发大鼠离体心脏心肌顿抑的研究

李新建1,张钢林1,邢少东1,苏全生2,赵广高3

(1.北京体育大学附属医院,北京 100084;2.成都体育学院,四川 成都610041;3.江西南昌大学,江西 南昌 330031)

目的:通过电超速驱动模拟运动负荷诱发心肌顿抑现象,建立离体大鼠心脏运动性心肌顿抑模型。方法:将 36只 SPF级成年雄性 SD大鼠随机分 6组,用电刺激模拟运动负荷的方法来对大鼠离体心脏施加超速驱动,并根据驱动时间的不同进行分组,再分别测量记录各组驱动前后各指标的变化情况加以分析。结果:(1)各组左心室收缩压、发展压在驱动全过程呈下降趋势,舒张压呈上升趋势,而驱动前组间室内压无明显差异。(2)各组冠状动脉流出液CK、LDH在驱动前无明显差异,驱动后各实验组水平均高于对照组。(3)驱动 20min组和 30min组的心肌坏死率明显高于其他组,而其他组两两比较无组间差异。结论:(1)运动性心肌顿抑存在。(2)过长的高心率负荷将不再发生心肌顿抑现象而出现大面积心肌坏死。(3)本实验中,运动性心肌顿抑存在于 5min组和 10min组中。

Langendorff灌流 ;超速驱动 ;运动性心肌顿抑;心功能;心肌坏死

心肌顿抑 (Myocardial Stunning)指心肌缺血再灌注后,尽管无不可逆损害,冠状动脉血流恢复正常或接近正常,但仍持续存在心肌机械功能障碍,此种功能障碍是完全可逆的。只要给予足够时间 (再灌注后数小时、数天或数周),心肌功能就可完全恢复[1]。其特点可简单概括为以下三个方面:①心肌顿抑发生时心肌功能出现障碍[2]。②心肌功能障碍是可逆的,可完全恢复。③顿抑发生期间心肌组织结构上无坏死现象发生。

实际生活中,为了提高训练成绩,运动员在训练期间,机体时常要完成大强度力竭性训练,以提高身体运动能力并不断突破自身生理极限。在运动过程中机体各系统的功能状态变化较为明显,过度的训练会使心肌产生损伤,而强度不够的训练又对提高机体的运动能力作用不大。鉴于此,训练中必须寻求一种合适的训练强度,即心肌顿抑出现时的最大训练强度为合适的训练强度。本实验通过检测心肌组织坏死面积和心功能两方面指标的方法,来建立离体心脏运动性心肌顿抑的模型,为建立运动性心肌顿抑模型奠定基础,并尽可能寻求运动性心肌顿抑发生时的训练强度、负荷,为进一步研究运动性心肌顿抑发生机制和寻求适当的训练强度以及心脏的超量恢复提供科学的依据和铺垫。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级成年雄性 SD大鼠 36只,体重为 200±20g,由成都中医药大学实验动物中心提供。标准啮齿目动物饲养笼分笼喂养,自由摄食饮水,鼠粮由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。保证通风条件良好,室温控制在 28-31℃,相对湿度 40-60%,自然光照。

大鼠购回后适应性饲养 2天,随机分为 6组,每组6只,又根据驱动时间的不同命名为 S组 (未处理组即preoperative组)、A组 (空白对照组,简称对照组或0min组 )、B 组 (5min组 )、C组 (10min组 )、D 组(20min组 )、E组 (30min组 )。

1.2 实验模型与方案

S组 (未处理组):大鼠麻醉后,迅速取出心脏放入4℃的 Krebs-Henseleit液中浸洗,再放入冰箱中冷藏,最后和其他组同时做 1%TTC中 37℃染色,做成切片进行坏死面积分析。

其它各组在取心浸洗后再用 K-H灌注液行Langendorff法灌注,并依靠电刺激模拟运动负荷的方法来施加超速驱动,驱动强度为能替代窦房结引起心脏收缩的最低强度,驱动频率以离体心脏跳动稳定后心率为基准,在此基础上逐渐递增刺激频率,递增的间隔为每两分钟递增 10%(5min组为每一分钟递增),递增至基础心率的 140%后不再增加,驱动时间分别为:A组 =0min、B组 =5min、C组 =10min、D组 =20min、E组 =30min,心脏灌流时间均为 90min,分别测量记录各组驱动前后左心室收缩压 (PSP)、舒张压 (EDP)、发展压(DP)以及冠状动脉流出液成分 CK、LDH的变化,并于90min后进行左室前壁心肌坏死面积分析。

1.3 测试样本的采集与处理

组织学指标的采集:各组在悬挂结束后冰盐水分别浸洗大鼠心脏,按短轴切面切成 5mm的心肌片 (重点采集左心室前壁的肌肉)再将心肌片立即置于 1%TTC中 37℃染色 20min。灰白色不着色组织为梗死区,砖红色为非梗死区。染色后的标本在 40g/l的甲醛中浸泡 24h固定,用两块聚丙烯透明板压平,然后将标本和缺血区轮廓在显微镜下拍照存入计算机,利用Media cybernetic Inc图像分析系统 image_pro media软件进行面积分析,确定心肌梗死面积百分比。

心功指标的采集:左心室收缩压 (PSP)、舒张压(EDP)、发展压 (DP)、心率的采集办法:剪开左心耳,将压力摇管 (内充满灌流液)端插入左心室,另一端接压力传感器,将压力信号通过传感器,经 RM-6000型四道生理记录仪无时间间隔地连续记录左心室压的变化情况,并描绘成曲线 (LVP),然后在该变化曲线上间隔寻找各指标不同时相的数值。

冠脉流出液的采集:在离体心脏悬挂开始和结束时分别接取冠脉流出液,分析其 LDH、CK变化情况。

1.4 数据处理

测得数据用均数±标准差(¯X±S)表示。采用SPSS13.0统计软件包进行方差分析。在方差齐性的情况下用 LSD法进行后效检验,方差不齐的情况下用Tamhane’s T2方法进行后效检验。以 P<0.05作为差异具有显著性的标准,以 P<0.01作为差异具有非常显著性的标准。

2 结果

2.1 表 1显示各组左心室收缩压、发展压在驱动全过程呈下降趋势,舒张压呈上升趋势,而驱动前组间室内压无明显差异。

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Note:※P<0.05,※※P<0.01 vs 0min group;#P<0.05,##P<0.01 vs 5min group;▲P<0.05,▲▲P<0.01 vs 10min group;★P<0.05,★★P<0.01 vs 20min group;△P<0.05,△△P<0.01 vs 30min group the same phase of group

2.2 表 2显示驱动 20min组和 30min组的心肌坏死率明显高于其他组,而其他组两两比较无组间差异。

Note:&P<0.05,&&P<0.01 vspreoperative group;※P<0.05,※※P<0.01 vs 0min group;#P<0.05,##P<0.01 vs5min group;▲P<0.05,▲▲P<0.01 vs 10min group;★P<0.05,★★P<0.01 vs 20min group;△P<0.05,△△P<0.01 vs 30min group

2.3 表 3显示各组冠状动脉流出液 CK、LDH在驱动前无明显差异,驱动后各实验组水平均高于对照组。

Note:※P<0.05,※※P<0.01 vs 0min group;#P<0.05,##P<0.01 vs 5min group;▲P<0.05,▲▲P<0.01 vs 10min group;★P<0.05,★★P<0.01 vs 20min group;△P<0.05,△△P<0.01 vs 30min group

3 讨论

3.1 运动性心肌顿抑模型建立的可靠性分析

根据评定于否发生心肌顿抑的标准来观察[3-6],本实验所得出的结果如下:在功能上,5min组、10min组的收缩压和发展压在超速驱动过程中出现不同程度的下降,在驱动结束即刻呈现一个明显的升高变化,随后虽有一个生理性下降变化,但紧接着又有一个升高变化,总体变化趋势呈恢复状态,且在恢复的最后阶段压力的变化趋势接近于对照组,与对照组相比无明显差异 (P>0.05),在驱动结束后出现的升高变化,可以理解为:电驱动停止靠窦房结自身起搏,频率下降心肌舒张更充分使得收缩较有力,从而收缩压和发展压呈现升高变化。而随后 5min组和 10min组出现的第二次升降变化则为心肌顿抑现象,即心功开始受到抑制随后得到恢复的变化过程;而第二次升降变化在20min组和 30min组并未发生,这意味着心肌顿抑现象没有在这两组中出现,即心肌未出现顿抑而是出现坏死;在变化趋势上,舒张压的升降虽然与收缩压、发展压相反,但其总体趋势也与它们一样,呈恢复状态,且在恢复的最后阶段压力的变化趋势也接近于对照组,与对照组相比无明显差异 (P>0.05);结构上:5min组、10min组与对照组在过程结束后得到的切片,经 TTC染色后发现各有不同程度的坏死,这与心肌顿抑的定义显得有些不相符合,但是造成其坏死的因素却包括各个方面 (环境、手术、灌流以及其他一些在离体环境下不能克服的因素),更重要的一点是:5min组、10min组与对照组染色后的切片经软件分析、统计、比较后发现,所测得坏死面积比率无明显差异 (P>0.05);冠脉流出液成分上:各组所采集到的液体浓度都偏低,但经比较后发现,5min组、10min组与对照组在过程结束后所测 CK、LDH结果无明显差异 (P>0.05)。

总之,通过实验结果可以发现:通过电超速驱动模拟运动负荷,可引起离体大鼠心脏左室收缩压明显下降、舒张压显著升高,左室发展压下降,驱动结束后一段时间,上述变化逐渐恢复到与对照组无明显差异,其心肌坏死区比率虽略高于对照组,但无显著性差异,表明电驱动能有效地诱发离体大鼠心脏心肌顿抑现象,提示运动性心肌顿抑的存在。

以上所得出的实验结果与评定标准经对比后发现,本实验此种变化情况基本符合心肌顿抑的变化规律[7-10],通过离体大鼠心脏建立的运动性心肌顿抑模型基本可靠。

3.2 离体心脏运动性心肌顿抑的发生时刻分析

根据心肌顿抑的衡量标准,本实验已经成功建立离体大鼠心脏的心肌顿抑模型。在此模型基础上,就心肌顿抑发生时刻的问题以四个方面来进行讨论。

(1)离体心脏的功能方面:根据表 1可以看出,各组驱动停止后即刻都出现收缩压和发展压的回升,但在随后的变化中则出现差异,5min组和 10min组在室内压的变化规律方面有相似之处:两组在超速驱动过程中,心脏功能均呈下降趋势,而从驱动结束即刻开始,心功马上开始恢复,并且出现两次升降变化,而20min组和 30min组则只出现一次升降变化;这种现象可以理解为:停止后即刻都出现收缩压和发展压的回升,是因为电驱动停止靠窦房结自身起搏,频率下降心肌舒张更充分使得收缩较有力,从而收缩压和发展压呈现升高变化。而随后 5min组和 10min组出现的第二次升降变化则为心肌顿抑现象,即心功开始受到抑制随后得到恢复的变化过程;而第二次升降变化在20min组和 30min组并未发生,这意味着心肌顿抑现象没有在这两组中出现,即心肌未出现顿抑而是出现坏死;在变化趋势上,5min组和 10min组舒张压的升降虽然与收缩压、发展压相反,但其总体趋势也与它们一样,呈恢复状态,且在恢复的最后阶段压力的变化趋势也接近于对照组,与对照组相比无明显差异 (P>0.05);20min组和 30min组舒张压恢复的最后阶段压力的变化趋势与对照组相去甚远,差异明显 (P<0.01);所以,就心功方面而言,5min、10min组可以理解为心肌顿抑发生组,20min、30min组则为非心肌顿抑组。

(2)离体心脏的组织结构方面:有学者认为[11],心脏缺血 20min引起心肌顿抑,缺血时间不同引起明显不同的缺血再灌注损伤后果,长期缺血引起心肌坏死,短时间缺血引起心肌顿抑,但在离体心脏究竟多长时间缺血仅造成心肌顿抑?早期认为离体大鼠心脏常温全心肌缺血 20min表现为可逆损伤,但未直接测量心肌组织的坏死程度[12]。并且缺血损伤的程度可能与动物大小、缺血时间、温度、操作、装置、灌注压和实验设计有关。

本实验中,根据表 2可以发现,由于离体环境、手术、灌流以及其他一些在离体环境下不能克服因素的原因,未处理组、对照组、5min组、10min组、20min组、30min组均出现不同程度的坏死情况,染色后的切片经软件分析、统计、比较后发现,所测得坏死面积[13-15]比率分别为 18.16±6.5%、21.90±15.9%、30.20±12%、30.8±11.2%、49.0±10.0%、49.7±21.1%,对照组、5min组、10min组两两比较无组间差异 (P>0.05),而 20min组、30min组和对照组相比则差异显著 (P<0.01),故坏死面积比率而言,5min、10min组可以理解为心肌顿抑发生组,20min、30min组则为非心肌顿抑组。

(3)冠脉流出液方面:关于大鼠离体心脏的灌流:经研究发现,大鼠心脏适于离体灌注 ,在各种实验动物中大鼠离体心脏有独特优点:心脏体积适于离体灌注、手术操作简便、价格低廉,用离体大鼠心脏还可排除麻醉药、神经、激素等影响心肌机械功能因素的干扰,如急性缺血早期,下丘脑、垂体和肾上腺激素水平上升,儿茶酚胺升高加速脂肪酸代谢、引起低血钾,加重心肌缺血。此外,离体心脏收缩不受前负荷、后负荷和心率的影响。在该模型心脏前负荷保持恒定,心率也可用电刺激维持稳定,这都是在体心脏所不能及的。

另外,从灌注液成分分析上来看,Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液类似哺乳动物血液,常用于离体心脏灌注,但两者毕竟不同。首先 K-H液不含细胞成分,携氧能力明显降低.在 37度晶体液经 950mL/L的 O2平衡后氧含量是 20mL/L,所以为维持与血液相同的氧供晶体液灌注时冠脉流量需增加 10倍。此外,由于细胞成分缺乏,产生于白细胞的自由基减少,血管内皮损伤后血小板和白细胞聚集引起的血管阻塞的现象亦减轻,这都使晶体液灌注模型的缺血再灌注损伤程度小于血液灌注。其次,溶液中仅有葡萄糖是能量代谢的底物。糖酵解产生的乳酸在高浓度时降低心肌收缩力,而低浓度时可能是另一能量来源。晶体液由于缺少胶体渗透压,随着灌注时间延长心肌水肿逐渐加重,加速心肌损害。

本实验中 10min组与对照组在过程结束后所测CK、LDH结果无明显差异 (P>0.05),而对照组与20min组、30min组在过程结束后所测 CK、LDH[16-19]结果差异明显 (P<0.01);所以说,从灌流液成分上来分析,心肌顿抑出现在 5min、10min组里。

所以,综合大鼠离体心脏在室内压、心肌梗死面积、冠脉流出液成分等各指标上的变化情况,可以得出结论:在本实验所采用的驱动强度、频率下,离体心脏运动性心肌顿抑在 5min组和 10min组中均有发生,这和已有类似研究所得出的结果有些接近。

4 总结

(1)通过电超速驱动模拟运动负荷,可引起离体大鼠心脏左室收缩压明显下降、舒张压显著升高,左室发展压下降,驱动结束后一段时间,上述变化逐渐恢复到与对照组无明显差异,其心肌坏死区比率虽略高于对照组,但无显著性差异,表明电驱动能有效地诱发离体大鼠心脏心肌顿抑现象,提示运动性心肌顿抑的存在。

(2)当超速驱动时间过长,则上述指标在驱动结束后未发生明显的恢复现象,且心肌坏死区比率明显增大,提示过长的高心率负荷将不再发生心肌顿抑现象而出现大面积心肌坏死。

(3)在本实验所采用的驱动强度、频率下,大鼠离体心脏运动性心肌顿抑在 5min组和 10min组中均有发生,而在 20min组和 30min组未见发生。

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Research on Overdriving-InducedM yocardial Stunn ing of Isolated Rat Heart

L i X in-jian et al

(Affiliated Hospital,Beijing SportUniversity,Beijing 100084)

Objective:To establish exercise-induced myocardial stunning model of isolated rat heart by using electrical overdriving to simulate load-induced myocardial stunning.Methods:36 SPF male rats are selected and randomly divided into 6 groups.Overdriving is carried out on isolated rat heart bymeans of electric st imulation simulated load.Groups are divided according to the different driving time.Index change for each group before and after the driving is recorded.Results:the PSP and DP of each group show a decreasing tendency in the whole process,while the EDP shows an increasing tendency.There is no marked difference in the ventricular pressure;there is no marked difference in the coronary CK and LDH for each group before the driving,while after the driving the exper imental group is higher than the control group;the heartmuscle necrosis percentage of 20-minute and 30-minute driving groups are higher than that of other groups,while no marked difference is found among other groups.Conclusion:the exercise-induced myocardial stunning exists;prolonged high heart rate load won’t generate myocardial stunning but itwill generate wide myocardiolysis.In this experiment,exercise-induced myocardial stunning exists in the 5-minute and 10-minute groups.

perfusion by the method of Langendorff,overdrive,exercise-induced myocardial stunning,heart function,myocardiolysis

G804.2

A

1001—9154(2010)04—0073—05

G804.2

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1001—9154(2010)04—0073—05

李新建 (1979—),男,河北赵县人,医学硕士,主要研究方向为运动医学。

2010—03—10