地锦组织培养及无性系建立研究

刘 洋 马 静 葛 宁 徐 娜 姜长阳

摘要以生长旺盛的地锦嫩茎为材料,进行了愈伤组织的诱导和分化、不定芽的分化及试管苗的生根、移栽、扦插和移植的研究,结果证明:MS+BA 0.4~0.6mg/L+2,4-D 1.5~2.0mg/L是诱导嫩茎形成具有分化能力愈伤组织的理想培养基;MS+AgNO3 0.8mg/L+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1mg/L是诱导愈伤组织分化培养的理想培养基;B5+BA 0.5mg/L+ NAA 0.1mg/L是不定芽分化培养的理想培养基;B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L是试管苗生根继代培养的理想培养基;移植的试管苗具有生长旺盛整齐、根系发达、开花结果时间推迟15d左右的特点。

关键词地锦;愈伤组织;不定芽;培养基

中图分类号 S567.21+9 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)21-0077-02

地锦(Euphorbia humifusa)又称地锦草、铺地锦、地锦大蓟,属于大蓟科大蓟属一年生草本植物,生长于荒地、路旁或田间[1,2]。除了广东、广西外,全国各地均有分布。地锦全草均可入药,具有清热解毒、凉血止血、利湿、消肿、退黄等功效,能治急性痢疾、肝毒赤白、肝炎、黄疸、咳血、尿血、便血、外伤出血、跌打损伤、热毒疮疼等疾病;外用能治跌打肿疼、皮肤湿疹、下肢溃疡、毒蛇咬伤等[3,4]。由于地锦具有多种药用价值,近年来人们进行广泛地采收,导致这种野生植物资源迅速减少。虽然现在已有大戟科药用植物组织培养研究的报道[5,6],但迄今未见地锦组织培养、无性系建立研究的报道。为保护地锦,满足人们需要,笔者对其进行了组织培养及无性系建立的研究。

1材料与方法

1.1材料及灭菌

6月中旬,把大连郊区农田中生长非常旺盛的地锦采回来后,将嫩茎剪下,放到250mL的磨口广口瓶中,流水冲洗15min左右,用0.05%安利洗涤液振荡洗涤约10min,再用蒸馏水洗至无泡沫时移至超净工作台上;倒入70%~75%乙醇灭菌约10s,迅速用无菌水洗涤1次,再用0.05% HgCl2溶液振荡灭菌16min,接着用无菌水振荡洗涤5次。再将无菌嫩茎切成长约0.3cm的茎段,接种到相应的固体培养基上,进行培养观察。

1.2培养条件

以MS和1/2MS为基本培养基,附加不同浓度的细胞分裂素和生长素。以MS为基本培养基时,加蔗糖30g/L;以1/2MS为基本培养基时,加蔗糖15g/L;培养基胨力强度为180g/cm2[7],pH值5.8~6.0,培养温度20~28℃,光照12h/d,光照度2 500Lx左右。

1.3试验方法

1.3.1愈伤组织的诱导。将无菌茎段接种到以MS为基本培养基,附加不同浓度的BA、IBA、2,4-D和IAA的培养基上,进行嫩茎愈伤组织的诱导培养。每处理接种100个茎段,重复4次。接种培养60d观察统计。

1.3.2愈伤组织的分化。把上述继代培养的愈伤组织分散成独立的颗粒状后,接种到以MS+ AgNO3 0.8mg/L为基本培养基,附加不同浓度的BA、IBA、NAA的培养基上进行愈伤组织的分化培养。每处理接种100个愈伤组织颗粒,重复4次。培养50d观察统计。

1.3.3不定芽的分化。把上述分化培养的不定芽从基部切下,分别接种到以MS+BA 0.5mg/L、1/2 MS+BA 0.5mg/L、1/3 MS+BA 0.5mg/L、B5+BA 0.5mg/L、White+BA 0.5mg/L、LS+BA 0.5mg/L为基本培养基,分别附加浓度为0.1mg/L的IBA、NAA和IAA的共18种培养基中,进行不定芽的分化培养和分化继代培养。重复4次,每次重复继代培养5代,每处理接种100个材料。培养45d观察统计。

1.3.4试管苗的生根培养。把上述分化培养的高0.7cm以上的不定芽从基部剪下,把下部切口在浓度为20mg/L的NAA溶液中处理5min后,接种到1/2 MS+IAA 0.1mg/L、1/3 MS+IAA 0.1mg/L、B5+IAA 0.1mg/L、White+IAA 0.1mg/L、LS+IAA 0.1mg/L等6种培养基上进行生根培养。每处理接种200个材料,重复4次。培养30d观察统计。

1.3.5试管苗的生根继代培养。把上述由不定芽培养的生根试管苗剪成长1cm左右、至少具有2个叶片的茎段,接种到MS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、1/2 MS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、1/3 MS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L、White+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1 mg/L、LS+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L等6种培养基上进行生根继代培养试验。每处理接种100个材料。重复4次,每次重复试验继代培养5代,培养25d观察统计。

1.3.6试管苗的移栽和扦插。打开继代培养瓶瓶塞,置于4 500Lx左右的光照下炼苗,4d后把试管苗从培养瓶中取出,剪下上半段,洗净基部的培养基后,把具有根的试管苗移栽到表层约为7cm厚的炉灰渣、下层为肥沃苗床土的温室苗床上,然后弥雾浇透水,保持湿度95%左右、温度20~28℃、无直射光照的条件。每处理移栽200个材料。重复4次,移栽后30d统计观察。把移栽试管苗剪下的上半段的下部剪口放到70mg/L的NAA溶液中处理4min后,扦插到已经浇透水并打上深约1cm 小孔的与移栽条件相同的温室苗床的炉灰渣上,随后弥雾喷浇清水淤闭插孔,再按照与移栽试管苗相同的条件进行管理。每处理扦插200个材料,重复4次,扦插后30d观察统计。

1.3.7试管苗的移植。把移栽和扦插成活的试管苗连续3年于6月上旬分2次移植到农田中栽培,每次移植400株。移植后每隔20d观察统计1次。

2结果与分析

2.1不同浓度的激素对愈伤组织诱导的影响

由表1可知,只有在不同浓度生长素、2,4-D的培养基上才能诱导茎段形成愈伤组织;其中在浓度分别为0.4 mg/L、0.6mg/L和0.8mg/L的BA与浓度为1.5mg/L、2.0 mg/L和2.5mg/L的2,4-D配合使用时,茎段能100%诱导形成愈伤组织,但诱导的外部形态却差异较大。其中浓度0.4 mg/L、0.6mg/L的BA与浓度为1.5mg/L、2.0mg/L的2,4-D配合使用时,不仅愈伤组织的诱导率达到了100%,而且愈伤组织的生长速度快,外观呈嫩绿色的颗粒状,颗粒之间连接较为疏松,容易分开。一般认为,这种愈伤组织为具有分化能力的愈伤组织[8]。把上述诱导培养的愈伤组织分散为独立的颗粒后,在相同的培养基上进行继代培养,每次重复试验连续继代培养7代的结果表明,不仅所形成的愈伤组织仍为绿色颗粒状的愈伤组织,而且愈伤组织继代培养的周期为50d,每个继代周期繁殖系数为24.5。这说明,MS+BA 0.4~0.6mg/L+2,4-D 1.5~2.0mg/L的培养基是诱导地锦嫩茎形成具有分化能力愈伤组织诱导培养的理想培养基。

2.2不同浓度的激素对愈伤组织分化的影响

观察表明,培养15d左右,在有的培养基上可见分化出不定芽。由表2可知,50d观察统计时,在不含任何激素、BA、IBA、NAA单独使用和BA与浓度分别为0.1mg/L、0.3mg/L的IBA配合使用的培养基上愈伤组织不能分化。而在0.3 mg/L、0.6mg/L的BA与浓度分别为0.1mg/L、0.3mg/L的NAA配合使用的培养基上,愈伤组织均能分化。但从愈伤组织的分化率、每个培养颗粒分化不定芽数和分化不定芽的长势看,在BA浓度为0.6mg/L、NAA的浓度为0.1mg/L的培养基上,不仅颗粒状愈伤组织分化率达到了95%、平均每个愈伤组织分化的不定芽数为7.1个,而且分化的不定芽长势好。4次重复试验的结果基本一致。由此可知,MS+ AgNO3 0.8mg/L+BA 0.6mg/L+ NAA 0.1mg/L是诱导地锦愈伤组织分化培养的理想培养基。

2.3不同培养基对不定芽分化的影响

观察统计表明,B5+BA 0.5mg/L+ NAA 0.1mg/L培养的材料,不仅平均分化率为95%,每个培养不定芽经过45d的培养,可分化形成6.4个、高0.7cm以上、茎粗0.13~0.20cm的不定芽,而且不定芽生长旺盛。不定芽继代分化培养的结果与上述基本一致。由此可知,B5+BA 0.5mg/L+NAA 0.1 mg/L是地锦不定芽分化培养的理想培养基。

2.4试管苗的生根培养

观察统计表明,在B5+IAA 0.1mg/L培养基上培养10d时,大部分培养的材料会生长出可见根,随后,伴随着根数的增加、根的生长,试管苗生长速度加快。培养到30d时,97%的培养材料会培养生长为具有5~11条根、12~23条气生根、高3.2~4.7cm、9~15片叶片、茎粗0.2cm左右、生长旺盛的试管苗。由此可知,把下部切口在浓度为20mg/L的NAA溶液中处理5min后,在B5+IAA 0.1mg/L培养基上进行不定芽生根培养的方法,是地锦不定芽生根培养的理想培养方法。

2.5试管苗的生根继代培养

观察表明,在B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L培养基上培养到7d时,大部分培养的材料会生长出1~2条可见根,随后,可见根数迅速增加,试管苗快速生长。培养到25d时,99%的培养材料会培养生长为具有7~16条根、约20条气生根、高4.4cm左右、约14片叶片、茎粗0.22cm、生长非常旺盛的试管苗。每个继代培养周期的繁殖系数为4.1。4次重复试验(继代培养5代)结果基本一致。由此可知,B5+IAA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L是地锦试管苗生根继代培养的理想培养基。

2.6试管苗的移栽和扦插

试管苗移栽后12d可见成活,并长出新叶;30d统计其成活率为99%,生长较旺盛。试管苗扦插后14d成活,并正常生长;30d统计其成活率为92%。扦插的试管苗前期生长较慢、植株较小,50d开始旺盛生长,60d外观长势与移栽苗基本一致。

2.7试管苗的移植

移植的成活率为99.5%。3年观察表明,移植的试管苗初期植株较小,生长速度较慢。移植60d后开始迅速生长。与野生植株相比,移植的试管苗出现了生长旺盛、长势整齐、根系增加1倍左右、开花结果时间推迟15d左右的特点,其他植物学性状保持不变。

3结论与讨论

以地锦的嫩茎为材料,成功地诱导形成愈伤组织,建立起生长旺盛、长势整齐、根系发达的嫩茎无性系,不仅证明地锦的非分生组织也具有全能性,而且还为该植物的人工保护和栽培奠定了技术基础。以愈伤组织继代培养的方法进行繁殖,50d的繁殖系数为24.5。按照这个速度,每年能繁殖出24.57.3个后代;用不定芽分化培养的方法进行繁殖,45d的繁殖系数为6.4,按照这个速度,每年能繁殖出6.48个后代;用生根培养的方法进行繁殖,25d的繁殖系数为4.1,按照这个速度,每年能繁殖出4.114.6个后代。由此可知,不论采用哪种方法进行繁殖,每年都能繁殖出大量的试管苗,满足人们的需要,但从试管苗移栽的角度看,应采用生根继代的方法进行繁殖。这是因为用生根继代的方法进行繁殖,不仅试管苗生长非常旺盛、没有无效苗,而且容易移栽成活。因此,生产和试验研究应采用生根继代的方法进行地锦试管苗繁殖。

现在用于生产的试管苗一般都采用茎尖等培养方法获得,而不采用愈伤组织的方法获得试管苗。这是因为很多研究者认为,愈伤组织容易发生变异,遗传的稳定性差[8,9],在本研究中由嫩茎愈伤组织获得的试管苗遗传性稳定,没有发生变异。这说明在通过组织培养建立的无性系研究中,所获得试管苗是否能保持遗传的稳定性,与所用试材和采用的研究方法有关。

4参考文献

[1] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志(第44卷:第三分册)[M].北京:科学出版社,1997.

[2] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第二册)[M].北京:科学出版社,1980.

[3] 南京中医药大学.中药大辞典(上册)[M].上海:上海科学技术出版社,2006.

[4] 韩全忠,王正兴.大连地区植物志(中册)[M].大连:大连理工大学出版社,1993.

[5] 于福科,马永清,李秀维.瑞香狼毒组织培养及快速繁殖[J].植物生理学通讯,2005,41(1):59.

[6] 陈芳清,丘安机,徐祥浩.药用植物红芽大戟的组织培养[J].广西植物,1997,17(2):149-151.

[7] 姜长阳.培养基琼脂用量计算的商榷[J].植物生理学通讯,1992,28(2):155.

[8] 安利佳,姜长阳.植物组织培养导论[M].大连:辽宁师范大学出版社,1996.

[9] 王国平,洪霓.果树的脱毒与组织培养[M].北京:化学工业出版社,2005.