聚焦生物工程中的“筛选”问题

袁锦明

近年来，关于生物工程中的“筛选”问题在各地的高考试题和模拟试题中多次涉及，它不仅考查了学生的分析推理能力、实验设计能力，还能考查学生获取信息应用知识的能力。下面，笔者就生物工程中的“筛选”问题作一具体分析。

1、基因工程中重组DNA分子的筛选

基因工程的第一步是提取目的基因，第二步是将目的基因与运载体结合，即把用同一种限制性核酸内切酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状的DNA。这些环状的DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物 、目的基因—目的基因连接物。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化。常用的方法有抗药性标记选择法（插入失活法），即将目的基因插入带amp^R和tct^R基因载体的tct^R基因（或amp^R基因）中，则tct^R基因（或amp^R基因）失活，再在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。

[例1]：(2008海南高考题) 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp^R为青霉素抗性基因，tct^R为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有__________、__________、__________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行__________。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________________。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是______________________________。

（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时 。

[解析]：考查基因工程重组DNA的构建与筛选，以及基因结构与表达调控。

(1)考虑载体的自连接、目的基因的自连接及载体和目的基因的相互连接。

(2)载体—载体连接物含有amp^R(青霉素抗性基因)和tct^R(四环素抗性基因)，其宿主细胞接种到含四环素、青霉素的培养基中均能生长。由于目的基因插入tct^R四环素抗性基因位置，使得该四环素抗性基因完整性破坏而不能表达，但因含有tct^R(四环素抗性基因)，所以将相应宿主细胞接种到含四环素的培养基中不能生长，接种到含青霉素的培养基中能生长。

(3)目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合位点是启动子，作为转录起始信号，其合成产物是mRNA。

(4)质粒包括EcoRI、BamHI酶切位点，目的基因的两端分别有EcoRI、BamHI酶切位点,若用该两种酶同时处理质粒、目的基因会得到相同黏性末端，其目的基因——载体连接物就只能有一种。当然还有若干载体——载体连接物、目的基因-目的基因连接物。

[答案]：

（1）目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物 分离纯化 （2）载体-—载体连接物；目的基因-—载体连接物、载体—载体连接物 （3）启动子 mRNA （4）EcoRI和BamHI

[例2]：科学家利用基因工程成功地将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内生产出人的胰岛素。在该过程中采用质粒作为运载体，已知质粒上含有抗氨苄青霉素（简称氨苄）和抗四环素的基因（位于不同区段），目的基因与质粒的结合位点刚好位于抗氨苄青霉素基因结构内，且受体大肠杆菌体内不含质粒，也不含质粒上的抗药基因。导入完成后，在得到的大肠杆菌中，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒，只有少数导入的是重组质粒。某科研机构想从培养基上筛选出含重组质粒的大肠杆菌（即“目的菌种”），他们设计了如下实验方案：

第一步：将得到的大肠杆菌接种在含的培养基上，筛选出含有质粒的大肠杆菌。

第二步：为选出“目的菌种”，将第一步筛选出的大肠杆菌中选用“印影法”分离。

①采用涂布平板法，将第一步筛选的大肠杆菌以合适的稀释度涂布_______________________上，经培养后形成单菌落，如图1B所示。

②通过一消毒的“印章”（如图1A所示），将培养基上的菌落分别按原位印迹到图1所示的非选择培养基__________和选择培养基__________上（顺序不能颠倒，C培养基成分与B相同，D上含有氨苄青霉素，含重组质粒的大肠杆菌不能生长）。

③培养后对照观察C、D培养基上的单菌落。

④在C培养基上挑取D培养基上不生菌落的位置上的单菌落，从而获得含重组质粒的大肠杆菌，即“目的菌种”。

⑤实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的的目的是____________________

[答案]：四环素 到含普通质粒的大肠杆菌和含重组质粒的大肠杆菌都能生长的培养基 C D防止污染环境

2、细胞工程中杂种细胞的筛选

2.1植物体细胞杂交中融合体的类型和杂种细胞的筛选

植物体细胞杂交中融合体的类型有以下三种：①未融合细胞：再生植株与亲本相同；②自体融合：融合结果得到“同核体”； ③异体融合：融合结果得到“异核体”。例如，在一定的技术手段（物理法、化学法）协助下进行植物A、B细胞的人工诱导融合，先进行膜的融合，再进行核的融合，最后形成杂种细胞，杂种细胞有三种：AA型、BB型、AB型，只有AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要进行筛选，再通过植物组织培养技术，培育成杂种植株。杂种细胞的筛选方法有以下几种：①利用双亲细胞形态和色泽上的差异识别杂种细胞，这是最简单的选择方法。②遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常的等位基因，纠正另一亲本的缺陷，从而使杂种细胞表现出正常功能的原理选择杂种细胞；③抗性互补筛选法：利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异来选择杂种细胞；④生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如，常用IOA（核失活—碘乙酰胺）处理与培养基相结合进行选择：A亲本用IOA处理，使细胞质不活化，这样A原生质体不能分裂；使用的培养基是不利于B亲本再生的培养基，这样B原生质体也不能再生，最后能再生的只能是A + B 体细胞杂种；⑤物理特性筛选法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电脉差异率等差异选择杂种细胞；

[例3]：（2001上海高考题）现有甲、乙两个烟草品种(2N=48)，其基因型分别为aaBB和AAbb，这两对基因位于非同源染色体上，且在光照强度大于800勒克斯时，都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果。取甲乙两品种的花粉分别按图示操作培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体，并将两者相混，使之融合，诱导产生细胞团。然后，放到大于800勒克斯光照下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。

（1）在大于800勒克斯光照下培养，有_______种细胞团不能分化。

（2）能分化的细胞团是由__________的原生质体融合来的(这里只考虑2个原生质体的相互融合)。

（3）由该细胞团分化发育成的植株，其染色体数是_______，基因型是_________。

（4）该植株自交后代中，在大于800勒克斯光照下，出现不能生长的植株的概率是_________

[解析]：根据题意，基因型aaBB和AAbb的个体在光照强度大于800勒克斯时都不能生长，这是由于它们中的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果，我们可推测出：能生长的植株一定同时含A、B基因。本题可用遗传互补筛选法解题，见右图所示。甲品种aaBB产生的花粉aB，花药离体培养成的植株为aB，乙品种AAbb产生的花粉Ab，花药离体培养成的植株为Ab，它们的叶肉细胞制成原生质体，将两者相混融合，诱导产生细胞团有aaBB、AAbb 、AaBb，只有AaBb在光照强度大于800勒克斯下能生长。AaBb的个体自交后代中出现不能生长的植株的基因型aa___或___bb的个体，能生长的植株基因型是AABB、AaBb、AABb、AaBB，由于AaBb的个体能产生四种配子其比例相等，其后代产生AABB的比例为1/4×1/4=1/16、AaBb为l/2×1/2=1/4、AABb为l/4×1/2=1/8、AaBB为l/2×1/4=1/8，这些个体之和为9/16，其余为能生长的个体，其比例为7/16。

[答案]：（1）2 （2）甲乙两品种 （3）48 AaBb （4）7/16

2.2单克隆抗体的制备中杂交瘤细胞的筛选

2.2.1杂交瘤细胞的第一次筛选

B淋巴细胞与骨髓细胞的融合随机性很大，因此，细胞融合过程中将会形成多种细胞的混合体，包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、B—B融合细胞、骨髓瘤—骨髓瘤融合细胞、B—骨髓瘤融合细胞（即杂交瘤细胞）和细胞多聚体（容易死亡，无需筛选）。在细胞混合体中，只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞才有意义，所以必须从不同种类的细胞中筛选出杂交瘤细胞。目前常采用HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞，其原理是：DNA的合成有D和S两种途径。B淋巴细胞具有D和S两种DNA合成途径，但一般不分裂增殖；骨髓瘤细胞只有一种DNA合成途径，即D途径，可无限增殖；杂交瘤细胞具有D和S两种DNA合成途径，它利用其中任何一个途径都可无限增殖。由于HAT选择培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质配制而成，由于氨基喋呤可阻断D途径，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，而且B淋巴细胞一般不增殖，淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。所以多种不同形式细胞的混合体在HAT选择培养液中，只有杂交瘤细胞能存活下来并不断增殖。

2.2.2杂交瘤细胞的第二次筛选

由于实验小鼠在注射目标抗原前，其体内已存在大量的病原体，因此小鼠体内会存在大量的针对不同种类抗原的免疫B淋巴细胞。所以在细胞融合时产生的杂交瘤细胞的种类也很多，但是只有与目标抗原有特异性的免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞才是所需要的。第二次筛选的常用方法：①放射性免疫测定：用于可溶性抗原细胞的单克隆抗体的检测；②酶联免疫吸附试验：用于可溶性抗原、细胞和病毒等的单克隆抗体的检测；③免疫荧光试验：用于细胞表面抗原的单克隆抗体的检测。利用上述方法选出针对目标抗原的抗体的阳性杂交瘤细胞。

[例4]：1975年科学家首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。请观察下图，回答问题：

（1）1984年以来，科学家针对如右图所示的单克隆抗体来自_________，应用于人体，会作为__________产生___________，加速排斥反应，以及完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效治疗的浓度等问题，制备出可用于肿瘤治疗的相对分子质量小的单克隆抗体。

（2）制备单克隆抗体的B淋巴细胞一般从 _______（器官）中采集。从下表看，用于筛选杂交瘤细胞的是特定的__________培养基。

[解析]：（1）目前，动物细胞融合技术最重要的用途是制备单克隆抗体，但不能理解为用书中介绍的例子——B淋巴细胞与老鼠骨髓瘤细胞融合，已经能够生产人类的单克隆抗体。由于单克隆抗体上仍带有鼠的抗原决定簇，患者仍然有可能产生针对于单克隆抗体的抗体，因此交叉反应产生免疫反应及过敏反应这一问题仍未得到解决。现在的目标是获得高药效低免疫性的人类单克隆抗体。（2）要制备针对某一目标抗原的单克隆抗体，必须用高纯度（纯度越高越好）的该目标抗原刺激实验动物（小白鼠）。由于脾是B淋巴细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾脏内皆会出现明显的抗体应答反应。因此，小鼠脾细胞内含大量的效应B淋巴细胞（针对该目标抗原的）。用于筛选杂交瘤细胞的是特定的选择培养基。

[答案]：（1）鼠异物免疫反应 （2）脾选择