猪瘟诊断方法研究进展探析

沈素芳　汤赛冬　成建忠

摘要 概述了猪瘟诊断方法的研究进展，包括血清学诊断方法和病原学诊断方法，为猪瘟诊断方法的实际应用提供了技术帮助。

关键词 猪瘟；诊断方法；血清学；病原学

中图分类号 S858.285.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）05-0215-01

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒引起的一种高度传染性的疫病，农业部将其列为一类传染病。猪瘟临床可分为急性型、亚急性型、慢性型、非典型型猪瘟，以出血性败血症变化为特征。猪是猪瘟病毒的唯一易感动物，本病流行广，传染快，死亡率高，一年四季均可发生。本病自 1833 年在美国俄亥俄州发现以来，流行世界各地，给养猪业造成了不同程度的经济损失。要控制猪瘟的流行和发生，必须强化猪瘟诊断方法的研究，数十年来，各国学者的倾力研究，促进了猪瘟诊断方法的的日趋完善和突破，为猪瘟的控制和消灭提供了良好的技术工具。

1 血清学诊断方法

猪瘟ELISA试验是世界动物卫生组织推荐的血清抗体检测方法。Clavijo等利用CSFV E2基因表达产物制成单克隆抗体，建立了竞争ELISA方法，利用此方法对临床健康猪和试验感染猪血清2 000份进行检测。结果表明其特异性和敏感性分别达到100%和86%，并能在人工感染后21d检测到抗体。周宗元等[1]应用猪瘟兔化弱毒抗原与HRP-SPA建立了HRP-SPA-ELISA方法检测CSFV抗体。周广森等[2]应用HRP-SPA-ELISA对某猪场40份母猪血清和240份仔猪血清进行检测，发现母猪中有10%隐性猪瘟感染者，仔猪中有3.7%的隐性猪瘟感染者，证明了隐性猪瘟的母猪是垂直传播和水平传播的传染源。Shannon等[3]报道抗原捕获ELISA能够检测2种不同株CSFV感染的病猪血液和组织中的抗体。余兴龙等[4]以在大肠杆菌中高效表达的CSFV E2基因主要抗原编码区（mE2）基因产物为抗原，以HRP标记的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测CSFV抗体的间接ELISA方法，试验证实用重组mE2蛋白作为诊断猪瘟的抗原，具有特异性高、易纯化和成本低等优点。Saunder、邱惠深、房德兴等分别建立了快速酶标微量技术、淋巴细胞杂交瘤技术和单克隆抗体ELISA抑制法等免疫酶测定技术，这些测定技术均以猪瘟单克隆抗体为基础[5-7]。

兰州所李树春等[8]进行了猪瘟间接血凝试验的研究。将猪瘟兔化弱毒株细胞培养物纯化后，用醛化绵羊红细胞致敏，制成间接血凝诊断液，用以检测血清中的猪瘟抗体效价。该方法具有操作简单、无需特殊仪器、快速和适于大量样品的检测等优点，非常适合基层单位的推广应用。

胶体金免疫层析技术是近几年国内外兴起的一种快速诊断技术，目前分为2类。一类是与仪器配套的自动化免疫分析，另一类是以硝酸纤维素膜为载体的快速免疫分析。金颜辉等[9]应用该技术进行了检测猪瘟抗体的研究，共测试了30份标准阳性血清和18份标准阴性血清，符合率100%，用该方法进行现场检测具有直观、准确、便捷等优点。

2 病原学诊断方法

荧光抗体试验是Robertso[10]于1965年首次报道的。主要应用于猪瘟病料和组织（Flurorescent Antibody，FA）培养物的检测。主要是用扁桃体、脾、肾、回肠末端等器官制作冰冻组织切片，或将病料乳剂接种于敏感细胞，培养后也可用FA检测猪瘟抗原。高免血清的制备是试验的关键，一般是将猪只免疫6次后提取血液，提纯免疫球蛋白，进行荧光素标记。目前已有多家商品化的产品可供选择。FA方法简便、快捷、可靠，所以许多国家将其作为执行猪瘟扑灭计划的法定诊断试验。

反转录聚合酶链反应（RT-PCR）是以病毒RNA为模板进行反转录后，再以PCR进行核酸扩增来检测CSFV的方法。罗廷荣等[11]应用RT-PCR对来自广西不同地区的135份疑似猪瘟病料进行检测，阳性率为6.2%。另从柳州地区采集的健康猪扁桃体和淋巴结276份，检测阳性率为13.4%。其中扁桃体检出阳性率高于淋巴结检出阳性率，证实了RT-PCR技术的临床诊断方法可行性。刘海鹏等[12]建立了口蹄疫病毒与CSFV的二联RT-PCR诊断方法，对2种病毒的敏感性可达到10-4倍稀释，约10pg的总RNA。证明了该方法对这2种病毒诊断的高度敏感、特异等特点。Liu等报道了用RT-PCR方法检测感染组织中的CSFV，其敏感性达到10-4TCID50。令人感兴趣的是当用巢式RT-PCR进行检测时，敏感性可提高1 000倍，这对疫病的及时诊断将有更大帮助。Choi等利用巢式RT-PCR对人工接种CSFV的5头公猪精液进行了检测，结果在接种后7d便检测出了阳性精液。

随着RT-PCR技术的日益成熟，实时PCR和荧光定量PCR以其灵敏、快速的优点赢得了关注。Risatti等（2003）应用荧光实时RT-PCR对CSFV快速检测进行了研究，试验结果表明该方法的敏感性可以达到甚至超过病毒培养[13]。而在扁桃体和肾中的病毒RNA可以在出现临床症状的前2～4d前检测出，试验只需不多于2h的时间。陈玉栋等（2003）建立了快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术[14]。该方法是在兔化弱毒株的5-UTR区设计了一对引物和一条荧光探针，利用荧光PCR原理，结合Light Cycler检测系统而建立的。结果表明，该方法灵敏度可达100个拷贝数，线形范围为6个数量级。利用该方法对9份疫苗样品进行了检测，与兔体定型热反应方法相比较有很好的相关性，更重要的是整个检测只需4h，极大地节省了时间，为CSF的及时诊断创造了有利条件。

检测猪瘟病毒抗原最具准确性的是猪瘟病毒的分离鉴定，可采取疑似病猪的淋巴结或脾脏等组织，研磨后做无菌处理，接种于原代细胞或传代细胞系进行病毒分离。目前应用最广泛、敏感性最强的传代细胞系主要有PK-2a（猪肾细胞系）和ST（猪睾丸细胞系）。

3 参考文献

[1] 周宗元，方元，顾志香，等.应用HRP-SPR-ELISA检测CSFV抗体的研究[J].兽医大学学报，1987，7（4）：391-396.

[2] 周广森，王学玲，苗志兰，等.用单克隆抗体ELISA监测猪瘟抗体发现隐性猪瘟[J].畜牧兽医学报，1997，28（4）：336-341.

[3] SHANNON A D，MORRISSY C，MACKINTOSH S G，et al.Dete-ction of hog cholera virus antigens in experimentally-infected pigs using an antigen-capture ELISA[J].Vet Microbiol，1993，34（3）：233-248.

[4] 余兴龙，涂长春，李作生，等.以重组Me2蛋白为抗原建立检测CSFV抗体间接ELISA方法的研究[J].中国预防兽医学报，1999，21（3）：220-222.

[5] SAUNDER A，BELZER F O，SOUTHARD J H.Effect of heart prese-rvation on mitochondrial function[J].Transplant Proc，1991，23（5）：2344-2346.

[6] 邱惠深.猪瘟单克隆抗体诊断试剂的研究[J].中国畜禽传染病，1991（6）：20-26.

[7] 房德兴.猪瘟单克隆抗体的研究与应用—抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体的纯化[J].中国兽医科技，1991，21（9）：46-47.

[8] 李树春，何建新，李德珍，等.猪瘟间接血凝实验的研究[J].中国兽医杂志，1993，23（7）：3-6.

[9] 金颜辉，黄印尧，张长弓，等.应用金免疫层析技术检测猪瘟抗体的研究[J].中国动物检疫，2004，21（4）：26-28.

[10] ROBERTSON A，GREIG A，APPEL M，et al.Hog cholera IV.Detection of the virus in tissue culture prepatations by the fluorescent antibody technique[J].Can J Comp Med Vet Sci，1965，29（9）：234-241.

[11] 罗廷荣，莫扬，吴文德，等.RT-PCR技术检测猪瘟病毒的应用研究[J].中国预防兽医学报，2004，26（4）：308-310.

[12] 刘海鹏，刘维全，江禹，等.口蹄疫与经典猪瘟二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用[J].中国畜牧兽医.2004，31（2）：33-35.

[13] RISATTI G R，CALLAHAN J D，NELSON W M，et al.Rapid detect-on of classical swine fever virus by a portable real-time reverse transcriptase PCR assay[J].J of Clinical Microbiology，2003，41（1）：500-505.

[14] 陈玉栋，张楚瑜，邹俊煊，等.建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术[J].中国病毒学，2003，18（2）：124-128.