转基因技术在动物遗传改良上的应用进展

刘中华　王华岩　乔宪凤　郑新民

摘要：简要介绍了几种比较常用的转基因方法，包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、胚胎干细胞法、病毒载体法、精于载体法、卵巢直接注射法。传统的转基因方法与基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰以及线粒体转移技术相结合，在基因功能研究和疾病治疗中发挥越来越重要的作用。特别是近年来在植物上出现的外源基因清除技术，为我们在动物上彻底去除外源基因的影响提供了新思路。

关键词：转基因技术；动物；外源基因：遗传改良

中图分类号：Q812；S813 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2009)02-0481-06

动物转基因技术是将外源基因导入人或动物细胞内，使外源性基因整合在染色体基因组上并稳定的传给下一代。1976年。Jaenisch等利用反转录病毒感染胚胎的方法进行基因转移，这是最早的动物转基因方法的应用。随后各国研究者相继在小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、山羊、鸡、蛙、鱼类等动物上获得成功，使用的方法也不尽相同，包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、病毒载体法、精子载体法等。传统的转基因方法与前沿的生物学技术如基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰等相结合，越来越显示了其强大的生命力。随着转基因动物技术的发展，转基因产品已经广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品等中。

1动物转基因技术

1．1显微注射法

显微注射法(microiniection)是指通过显微操作仪将外源基因注入受体动物受精卵的细胞核中，外源基因整合到受体细胞染色体上，发育成转基因动物的技术。1980年，Gordon等L2)利用显微注射的方法将构建的HSV-Tx融合基因转入小鼠的基因组，在得到的78只仔鼠中有2只为转基因动物。1982，Palmiter等L3)应用显微注射技术成功地将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄原核中，获得了整合并表达外源性生长激素的超级转基因“硕鼠”。

显微注射法是发展最早、使用最为广泛也是最，为有效的转基因方法之一。Zhu等利用显微注射法生产出转sFat-I基因小鼠。Tang等利用此法制备㈩乳腺中可表达重组抗CD 20抗体的转基因小鼠、Manoi等将TAIL-PCR技术用于分析显微注射导致的整合位点不确定中，进一步拓展了该方法的应用范围。目前，利用此方法已成功的生产出了小鼠、兔、绵羊、猪、牛、鱼和鸡等各种转基因动物。

1．2脂质体介导法

脂质体(liposome)特别是阳离子脂质体(cation-ic liposome)目前是实验室进行转基因研究的一种常规方法。该方法具有生产简便、毒性低、无感染危险等优点。有别于其他类型的脂质体，阳离子脂质并不将DNA包裹在其脂质双分子层中，只需将二者直接混合即可得到一种稳定的复合物——liooplexes，因此，复合物的形成不受DNA体积大小的限制。

1．3电转染法

自Muramatsu等将电转染(eleetroporation)应用于小鼠睾丸细胞获得成功以来，电转染目前已成为基因转移的高效且常规的手段之一。董菊子等对转染前孵育温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对电转染效率有影响的因素进行了系统研究，摸索出电转染的合适条件。Umemoto等将pCA GGS-lacZ基因电转染小鼠睾丸并设计了一系列对照，结果电转染对小鼠后代的数量并无显著影响。Nataeha等川在研究改进一种新的WISH方法时也使用了电转染方法。

1．4胚胎干细胞法

胚胎干细胞(ESC)是从早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系，注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎形成嵌合体，直至达到种内嵌合，因此可将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。Capeeehi等首先对小鼠ES细胞进行了基因打靶，然后将此打靶的ES细胞移植进入小鼠囊胚，将此重组胚移植进入代孕母鼠，最后产出嵌合体仔鼠，通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。ES细胞介导技术是公认的研究基因转移、基因定位整合的一类极有前途的实验方法。此法可使受体动物细胞中基因整合率达到50％，其中生殖细胞整合率达30％。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。

1．5病毒载体法

目前使用较多的是逆转录病毒感染法(retro-virus-mediated gene transfer)。该方法是利用逆转录病毒DNA的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中。携带外源基因的逆转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。1974年，Jaenish等将SV40 DNA注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠体内有SV40 DNA整合。次年，他又成功地用鼠白血病病毒(MuLV)作为载体，将外源基因导入小鼠胚胎。1990年，Harvcy用猫白血病病毒作为载体，也成功地将外源基因导入去透明带的羊胚胎中。目前，逆转录病毒载体已广泛应用于各种动物的转基因研究中。

另一种常用的是腺病毒感染法(adenovirus-mediated gene transfer)。科学研究者已经对这类载体进行了3次改造，使其在外源DNA装载容量、安全性、外源基因表达的稳定性和转染效率等方面得到了很大提高。Matthias等利用腺病毒将转化多能干细胞的4个必需基因转染到小鼠的正常细胞内，腺病毒直接作用于蛋白质而不是染色体，不会改变宿主DNA，并且经过几次分裂后就会被清除，因此不会对细胞产生危害。通过这种方法，研究者已经从大鼠皮肤细胞、胚胎肝细胞以及成熟肝细胞成功且安全地诱导出了多能干细胞。

总的来说。病毒介导的基因转染效率高，可携带大片段的DNA进行转移，但其靶向性和组织特异性差。生物危害比较大，可引起感染及炎症反应，因此其应用受到一定程度的限制。

1．6精子载体法

早在1971年，Brackett等研究发现，兔精于和3H-胸腺嘧啶标记的SV40 DNA共温育，在精子头部的顶体后区可检测到放射性物质存在，当这些精于和CV-1肾细胞融合后可以分离到具有感染性的SV40病毒，这些证据显示兔精于具有吸附外源DNA的能力。1989年Lavitrano等首次利用小鼠附睾精于与DNA温育产生转基因小鼠，称之为精于介导的转基因法(SMGT)。Sato等通过直接注射外源DNA到小鼠睾丸内完成转基因，发展了一种新的转基因途径，即睾丸介导的转基因法(TMGT)。Sato等向小鼠睾丸内注射台盼蓝和Hoechst33342染料，发现这些染料1min内即可通过附睾头导管传遍睾丸网。Shen等直接向雄兔睾

丸内注射携带绿色荧光表达的外源DNA及二甲基亚枫的介质，使DNA能够进入睾丸细胞和生精细胞，1个月后用处理的雄兔与雌兔交配，所产后代中56％的仔兔能高效地表达所导入的外源基因，Ko-jima等rD将携带报告基因LacZ的腺病毒载体直接注射到小鼠睾丸内，之后利用PCR、RT-PCR、免疫组化对其生殖系细胞和后代进行检测，发现腺病毒载体只能感染非生殖细胞，不能传给下一代，因而研究者可以将腺病毒介导的转基因技术应用于体细胞功能障碍引起的雄性不育研究中。

1．7卵巢内直接注射

人们在研究利用精于作为载体进行动物转基因同时，也试验了雌性生殖系统转基因的可行性、Gordon率先尝试向小鼠卵巢内直接注射包含报告基因LacZ的腺病毒载体。结果表明腺病毒载体不能感染卵子，这种载体在雌性生殖系转染效率是很低的。两年后，Sato等将质粒DNA注射到小鼠卵巢中并进行体内电转染，转基因效率变化较大(8％～60％)。Yang等直接对小鼠的卵巢注射表达质粒plRES-EGFP，得到了转基因小鼠，检测后代的阳性率达54％，并且发现获得的转基因小鼠6代以内都具有较好的遗传稳定性。

2动物转基因技术的应用

2．1基因打靶与转基因

基因打靶(cerie targeting)是基因同源重组技术的一种，就是利用同源重组的原理，用外源性DNA定点修饰改造染色体目的基因的方法，包括基因敲除(knock out)和基因敲入(knock in)技术。基因打靶实际上是转基因学、同源重组和胚胎干细胞3种技术结合的产物。

Brown等成功地在人正常二倍体成纤维细胞中敲除了p21基因，揭示了p21与细胞衰老间的关系。Chan等在HC7116细胞系中成功敲除了14-3-3σ基因，证明该基因在DNA发生损伤后参与维持G2期检验点并阻止细胞死亡。但质粒载体转入细胞及整合进特异位点的效率较低，增加了试验的成本和操作的复杂性。重组腺相关病毒(rAAV)载体的出现在一定程度上克服了上述缺点。Topaloglu等分别利用质粒载体和腺病毒相关载体对人直肠癌细胞系p53基因进行打靶，结果显示腺病毒相关载体打靶效率是质粒载体的25倍。人们在常规基因打靶的基础上引入Cre/loxP系统，建立了一种可以在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶(spatiotempo-ral gene targeting，STGT)技术。He等用Syn-Cre小鼠研究大脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体在癫痫发病中的作用，Lin等构建Ksp-Cre小鼠特异性地敲除肾脏上皮细胞纤毛蛋白KIF3A和转录因子HNF-1B，均采用了该技术。

2．2体细胞核移植与转基因

利用基因工程技术将目的基因整合到动物体细胞染色体中，并将其作为供体核移植入受体(去核卵母细胞)构成重建胚，然后将其植入假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到经定向遗传修饰的转基因克隆动物。这其实是体细胞核移植技术与转基因技术结合的产物。体细胞核移植技术路线所获得的转基因动物，其机体各组织细胞均源自于最初形成重构胚的体细胞核，理论上来说由其所形成的转基因动物应该全身的各组织细胞都具有同供核细胞一样的基因型，而通过其他途径获得的转基因动物有时会出现嵌合基因。

国外很早就有这方面的报道，Lai等叫采用核移植技术生产出世界第一只绿色荧光蛋白转基因猪。张运海等叫利用体细胞核移植技术生产出表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎：东北农业大学生命科学学院刘忠华等以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体，以体外成熟卵母细胞为核受体，构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎，并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究，共出生克隆猪6头，其中4头为GFP阳性，表明我国科学家已经具备采用体细胞核移植技术路线制作转基因猪的全部技术。

2．3RNA干扰与转基因

RNA干扰(RNA interference)是双链RNA介导的特异性基因沉默现象，是真核生物中普遍存在的古老而保守的自身防御机制和内源性基因表达调控机制，1998年Fire等C38，首次发现RNA干扰现象，随后RNA干扰的基础和应用研究迅速成为21世纪初生命科学中的热点领域。一直以来，基于同源重组的基因敲除技术是研究内源性基因功能缺失的主要手段，但其缺点是耗时费力，难度较大。近年发展的RNAi技术与转基因技术相结合，通过抑制内源基因的表达或mRNA的降解，特异地、部分地和可逆地使目的基因表达下调沉默，从而实现基因调控的时空性和可逆性。

Paula等利用原核显微注射法向小鼠卵子内导入卵子特异性启动子Z03启动的打靶Mos mR-NA的长双链RNA，成功的生产出转基因后代。Williams等针对睾丸特异性基因PLC-l设计shRNA，然后克隆进入载体，显微注射人小鼠睾丸，克服了长期以来雄性生殖细胞体外难以培养的缺点。随后研究者利用Cre/LoxP系统，已经开发出在时间和空间上可调控的RNA干扰技术。Diekins等将启动子四环素反应元件(tetracyclin responseelement.TRE)与RNA干扰基因一起克隆进载体并转入小鼠中，然后该小鼠与含有四环素转录激活因子的转基因小鼠杂交，制备同时含有两套元件的转基因小鼠，就可以通过四环素药物的投放来实现RNA干扰的可逆调控。因此利用RNAi制作降低或抑制某些基因或性状的转基因动物，将是一种非常奇妙和有前景的领域。

2．4线粒体与转基因

由于大多数转基因动物受遗传镶嵌性和杂合性的影响，其有性生殖后代变异很大，难以形成可稳定遗传的转基因品系。线粒体是普遍存在于动植物细胞内的一种具有半自主性的细胞器，线粒体DNA呈双链环状，其遗传主要表现为母性遗传，雄性配子对受精卵mtDNA的贡献不到0.01％。以线粒体作为转基因载体，即先从受体动物细胞分离出线粒体，再用外源基因对这些线粒体进行离体遗传转化，然后把转基因线粒体导入受体动物受精卵，那么由此发育而成的转基因动物就避开了外源基因在染色体上难于整合及随机插入等问题。

目前利用线粒体作为转基因手段的研究还处于摸索阶段。Ebert等将异源线粒体注射人小鼠胚胎，经过注射的胚胎移植后发育正常，但在出生的仔鼠中检测不到异源线粒体。Pinkert等将从Mus spretus系小鼠肝细胞中分离到的活的线粒体显微注射人原核期的M.Musculus系小鼠胚胎中，在注射的217枚胚胎中，67枚存活，其中23枚经4.5d的体外培养后发育到囊胚。巢式PCR检测的结果表

明，经过显微注射的M.Musculus系小鼠胚胎在体外培养时，无论是0.5d还是4.5d均能检测到Musspretus系小鼠的线粒体。Irwin等将201枚经异源线粒体显微注射的小鼠胚胎移植到假孕母鼠的输卵管，在生出的93只仔鼠中有5只(3雄2雌)能检测到异源线粒体。其中3只雄鼠与M.Musculus系雌小鼠交配，在出生的后代小鼠中(41只)无一例能检测到异源线粒体。这是预料中的。两只转线粒体雌鼠中，一只能将异源线粒体传递给后代小鼠，另一只不能。线粒体也可以在不同物种间进行转移，Sokolova等从人肝脏细胞中分离出线粒体，显微注射到小鼠合子，再植入假孕母鼠体内发育，F代小鼠许多组织器官中检测到了人体线粒体，Yi等将小鼠肝细胞分离的线粒体注射入小鼠受精卵后体外培养，囊胚形成率为37.65％，与未注射组20.91％相比，差异显著，证明异源线粒体可促进小鼠胚胎发育。

上述研究表明动物个体之间进行线粒体转移是可能的，但转线粒体基因与转核基因存在很多明显的区别，这主要是由于核基因与线粒体基因表达特征决定的。外源mtDNA在宿主细胞中的存在形式有两种可能，要么在核遗传物质与线粒体遗传物质转移过程中，进入到宿主线粒体。与宿主mtDNA共存同一线粒体中：也有可能是外源线粒体DNA在宿主细胞中，重新组装成为新的线粒体。这还有待进一步研究。

3外源基因清除技术

外源基因清除技术(Gene-Deletor)是美国康涅狄格大学华裔教授李义领导的研究小组发展起来的，有望成为解决转基因植物环境安全性和食品安全性问题的有力工具。该技术综合利用了两套位点特异重组酶的元件，即来源于细菌噬菌体的Cre/LoxP系统和来自于酵母的FLP/FRT系统，这两套系统均通过重组酶识别特定的重组位点将插入该位点间的所有外源基因删除。Cre/LoxP和FLP/FRT系统已经分别用于删除转基因植物的筛选标记序列。外源基因清除技术综合应用了两套系统，创造了一个loxP和FRT的融合识别位点LF(LoxP-FRT)，获得了一个高效基因清除系统。特异启动子驱动重组酶FLP或者Cre在适当的时间和部位表达，重组酶识别融合识别位点LF.两个融合识别位点之间的序列(包括重组酶的基因序列)在特定的时期、从特定植物器官的细胞基因组中全部清除。与以前的相关技术相比，外源基因清除技术具有几个显著优点：①能够将转基因植物花粉和种子中的外源基因全部清除。②大幅度地提高了转基因植物中外源基因的删除效率。实验证明，在3万多株转基因烟草后代植株中，基因清除效率达到了100％。③外源基因清除技术更适合于生产上应用，尤其是在第二代(生产者和消费者都受益的性状改良)和第三代(以转基因植物作为生物反应器)基因工程产品生产中更有应用价值。Gu等首先提出了Cre/LoxP系统(包括Cre重组酶和loxP位点两部分)。人们很早就在小鼠上应用Cre/LoxP系统进行研究。Carolyn等在小鼠上试验后认为FLP/FRT系统是Cre/LoxP系统的一种有效的替代。我们当前面临的任务是如何对Gene-Deletor技术进行一些改造。将其应用在动物上，这必将给动物转基因技术带来一些革命性改变。

4问题及展望

目前动物转基因技术发展迅速，已经在鼠、猪、牛、羊、兔等多种动物上获得成功。但还存在一系列问题制约着转基因动物的生产规模，如转入基因的内在作用机制研究的还不够深入，转基因动物制作效率还比较低，转入的选择标记性基因还没办法有效清除等等，这些都限制着转基因动物产品的研究与开发。传统的转基因技术与新近出现的分子生物学研究手段相结合，丰富了转基因研究领域。基因打靶技术和体细胞克隆技术的发展，为转基因动物的制备提供了一个良好的平台；基因打靶与RNA干扰结合转基因技术，为获得对于特定基因进行表达的可控、可逆等精细调控提供了新的途径：线粒体做为转基因载体，将避开外源基因在染色体上难于整合及随机插入等问题：外源基因清除技术如果应用到动物上，就可以将转入基因在发挥作用后及时清除掉。可以预见，随着各种新的生物技术的出现和发展，转基因技术必将变得更加快捷、方便、高效，能更好的用于制备各种新颖的转基因动物，在动物新品种培育、医学疾病模型研究和生物制药等领域发挥更加重要的作用。

(责任编辑昌炎新)