重金属镉、铅胁迫对茭白DNA交联的影响

黄凯丰 江解增

（1.扬州大学水生蔬菜研究室，江苏扬州，225009；2.贵州师范大学生命科学学院植物遗传育种研究所）

重金属镉、铅胁迫对茭白DNA交联的影响

黄凯丰1,2江解增1

（1.扬州大学水生蔬菜研究室，江苏扬州，225009；2.贵州师范大学生命科学学院植物遗传育种研究所）

以单季茭白品种蒋墅茭和双季茭白品种葑红早为试材，对Cd2+、Pb2+的单一及其复合胁迫，进行有机肥和无机肥处理，测定了两茭白品种叶片中DNA的提取量以及DNA增色效应的变化。试验结果表明，Cd2+、Pb2+胁迫均能显著降低两茭白品种叶片中DNA提取的量及DNA增色效应的程度。不同胁迫处理方式间以复合胁迫处理下茭白叶片中DNA提取的量显著低于单一胁迫处理，复合胁迫处理时茭白叶片DNA的增色效应下降的幅度显著大于单一胁迫处理。不同肥料处理间则以无机肥处理时DNA提取的量显著低于有机肥处理；而无机肥处理时茭白叶片DNA增色效应下降的幅度显著大于有机肥处理。品种间同比均以蒋墅茭较高。

重金属 复合胁迫 DNA提取量 DNA增色效应

分析目前有关重金属污染对作物伤害机理的研究资料，不难发现，极大部分研究报告均集中于研究重金属胁迫条件下作物生长发育的外在表型、内部结构、酶活性差异及过氧化胁迫过程，即着重于研究环境污染物对作物伤害的生理、生化后果，对其成因，尤其是对作物DNA毒性及与此相关的基因组正常表达的干扰的研究相当少，有的甚至还是空白。

目前关于重金属离子胁迫对DNA的伤害主要集中在动物和人体的细胞。Corvetti等[1]，Whiting等[2]的研究发现，重金属离子胁迫可导致动物和人体细胞期外DNA合成速率的大幅度提高；Popp等[3]，Stearns等[4]，Tama等[5]发现，重金属离子胁迫可导致动物和人体细胞DNA的断裂；同时重金属离子胁迫也可造成动物和人体细胞DNA产生DNA-蛋白质、DNA链间交联[6～8]，进而干扰基因组的正常表达，导致癌和其他疾病的发生。那么，重金属污染是否也对茭白（Zizania latifoliaTurcz.）的DNA产生损伤呢？因此，本文以江苏省特色水生蔬菜茭白为研究对象，研究了其在不同肥料处理下，Cd2+，Pb2+单一及其复合胁迫对茭白叶片细胞中DNA交联的影响，以期为重金属离子对茭白伤害机理的研究提供一些科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试重金属离子为：Cd2+（CdCl2·2.5H2O）、Pb2+[Pb（NO3）2]均为分析纯。

供试茭白品种：单季茭品种蒋墅茭、双季茭品种葑红早。

表1 重金属对茭白叶片DNA提取量和增色效应的影响

1.2 种植管理

试验在扬州大学水生蔬菜试验水池中进行。2007年4月24日，将取自扬州大学水生蔬菜试验田的土壤 （Cd2+含量0.16 mg/kg；Pb2+含量0.17 mg/kg，pH值7.54）按20 cm的厚度，铺设到每个水泥池中，每个水池长1.5 m、宽1 m、深0.5 m，在各池中分别施有机肥（菜籽饼：1500 kg/hm2）和无机肥（与菜籽饼N，P，K含量相当的三元复合肥：750 kg/hm2）做基肥，灌水至30 cm，并在试验过程中通过不断的灌自来水来保持该水位。5月13日，选择大田中上年种植的、具有典型种性的茭墩分墩移栽，每墩带有3～5支新生分蘖并有少量老墩，均匀栽植于水池中，行距 30 cm，株距35 cm，每池中均栽两品种茭白各6墩，品种间用滤网分隔。

待茭白植株返青成活、长出新叶后，于5月25日，按土壤和水的总体积为准设置重金属浓度，Cd2+：100 mg/L(以 Cd 100表示)；Pb2+：1000 mg/L（以 Pb 1000表示)、Cd2+-Pb2+复合污染（Cd2+100 mg/L，Pb2+1000 mg/L，以Cd-Pb表示），向池中均匀投放高浓度的CdCl2·2.5H2O、Pb（NO3）2母液，并搅拌均匀，设空白对照，3次重复。茭白生长过程中，分别在返青、分蘖期、孕茭期，按225 kg/hm2用量施三元复合肥在无机肥处理的水池中；按450 kg/hm2的用量施菜籽饼在有机肥处理的水池中。管理过程中所有枯叶均放入水池中沤烂，以尽量避免重金属的损失。保持水池中的水位，水池上方2.5～3.5 m覆盖塑料薄膜，以防止降雨。

1.3 样品处理及测定

于2007年6月2日，在各处理小区中随机选择两茭白品种的倒三片功能叶，洗净并吸干表面的水珠，取叶尖约1 cm位置，剪碎混匀，以1.00 g每包，在液氮中处理5～10 min，取出后放入-80℃冰箱中保存。

采用CTAB法[9]提取茭白叶片中的DNA，并于-20℃冰箱中保存备用。采用葛才林等[10]的方法，测定DNA增色效应指标，用以研究重金属引起的DNA交联。

2 结果与分析

2.1 重金属胁迫对茭白叶片DNA提取量的影响

由表1可以看出，Cd2+，Pb2+胁迫能显著降低两茭白品种叶片中DNA提取的量，说明重金属离子胁迫能显著增加茭白叶片中不能被提取的DNA的量。不同胁迫处理间以复合胁迫处理下茭白叶片中DNA提取的量显著低于单一胁迫处理。不同重金属离子胁迫间则以Pb2+胁迫下提取的DNA的量显著高于Cd2+胁迫处理。不同肥料处理间表现为：有机肥处理下茭白叶片DNA提取的量显著高于无机肥处理。品种间存在差异，以蒋墅茭同比高于葑红早。

2.2 重金属胁迫对茭白叶片DNA增色效应的影响

由表1可以看出，重金属离子胁迫能显著降低两茭白品种叶片DNA增色效应的程度。不同胁迫处理间以复合胁迫处理下茭白叶片DNA增色效应下降的幅度显著大于单一胁迫处理，相差达2～3倍。Cd2+、Pb2+胁迫间相比，以Pb2+胁迫处理下茭白叶片DNA增色效应下降的幅度显著小于Cd2+胁迫处理。不同肥料处理间相比表现为：有机肥处理下茭白叶片DNA增色效应下降的幅度显著小于无机肥处理。品种间则以蒋墅茭同比高于葑红早。

3 小结与讨论

葛才林等[10]的研究发现，重金属离子胁迫能降低水稻、小麦叶片中DNA提取的量，且不同重金属离子胁迫间存在差异，本试验得出相似的结果。夏寿萱[11]认为，在进行DNA提取时，不能被提取部分的比例增大，即提取DNA量的减少，其主要原因是DNA和蛋白质之间形成了交联。从本试验的结果可以看出，DNA和蛋白质之间的交联，在茭白叶片中同样存在，且以无机肥处理和复合胁迫处理时，其交联的程度分别大于有机肥处理和单一胁迫处理。

Duguid等[6]的研究表明，二价金属离子（如Cd2+, Ni2+，Co2+，Mn2+，Ca2+，Mg2+）能造成两条不同DNA链的交联，引起小牛胸腺DNA“片段”的凝聚，使DNA的熔解温度Tm大大提高，且不同二价阳离子促使DNA链间交联的能力也不相同。从本试验的结果可以看出，不同重金属离子胁迫均能显著降低茭白叶片DNA的增色效应，这可能是因为重金属离子胁迫能促进DNA“片段”的凝聚，使茭白叶片中的DNA发生链间交联，从而使DNA的熔解温度显著提高，导致在加热至70℃时，DNA仍不能解链，因而70℃条件下仍未见明显的DNA增色效应。本试验中无机肥处理、复合胁迫处理下DNA增色效应的程度分别显著低于有机肥处理、单一胁迫处理，说明茭白在无机肥处理、复合胁迫处理下，其DNA交联的程度大于有机肥处理、单一胁迫处理。

[1]Corvetti G,Fornaro M,Geuna S,et al.Unscheduled DNA synthesis in rat adult myenteric neurons:an immunohistochemical study[J].Neuroreport,2001,12:2165-2168.

[2]Whiting R F,Wei L,Stich H G.Enhancement by transition metals of unscheduled DNA synthesis induced by isoniazid and related hydrazines in cultured normal and xeroderma pigmentosum human cells [J].MutatRes,1979,62:505-515.

[3]Popp W,Vahrenholz C,Schmieding W,et al.Investigations of the frequency of DNA strand breakage and cross-linking and of sister chromatid exchange in the lymphocytes of electric welders exposed to chromium-and nickel-containing fumes [J].Int Arch Occup Environ Health,1991,63: 115-120.

[4]Stearns D M,Kennedy L J,Giangrande P H,et al.Reduction of chromium(Ⅵ)by ascorbate leads to chromium-DNA binding and DNA strand breaks in vitro [J].Biochemistry, 1995,34:910-919.

[5]Tawa R,Takami M,Imakura Y,et al.Breaks in doublestrand DNA by Cu(Ⅱ)complexes of etoposide(VP-16)and its derivatives,as evaluated by S1 nuclease treatment[J]. BiolPharmBull,1997,20:1002-1005.

[6]Duguid J G,Bloomfield V A.Aggregation of melted DNA by divalent metal ion-mediated cross-linking [J].Biophys J,1995,69:2642-2648.

[7]Mattagajasingh S N,Misra H P.Mechanisms of the carcinogenic chromium (Ⅵ)-induced DNA-protein cross-linking and their characterization in cultured human cells[J].J Biol Chem,1996,271:33550-33560.

[8]Misra M,Olinski R,Dizdaroglu M,et al.Enhancement by L-histidine of nickel(II)-induced DNA-protein cross-linking and oxidative DNA base damage in the rat kidney[J]. Chem Res Toxicol,1993,6:33-37.

[9]上海植物生理学会.植物生理学实验手册 [M].上海：上海科技出版社，1985：191-192.

[10]葛才林，杨小勇，孙锦荷，等.重金属胁迫引起的水稻和小麦幼苗DNA损伤[J].植物生理与分子生物学学报，2002，28（6）：419-424.

[11]夏寿萱.放射生物学[M].北京：军医医学出版社，1998：87-88.

Effect of Cadmium and Lead Stress on the DNA Cross-linking inZizania latifolia

HUANG Kaifeng1,2,JIANG Jiezeng1
(1.Institute of Aquatic Vegetable Research,Yangzhou University,Yangzhou 225009; 2.Institute of Plant Genetics and Breeding,School of Life Sciences,Guizhou Normal University)

To study the contents of dietary fiber(DF)and crude fiber in gall's ofZizania latifoliagrown in stress with Cd2+100 mg/L,Pb2+1000 mg/L and their combined stress,a single-harvested cultivar Jiangshujiao and a double-harvested cultivar Fenghongzao ofZizania latifoliawere cultured in soil with organic fertilizer(OF)and inorganic fertilizer(IF).The results showed that,Cd2+and Pb2+stress could reduce the amount of extracted DNA and the hyperchromicity of DNA in the leaves ofZizania latifoliaremarkably.Treated with combined stress of Cd2+and Pb2+,the amount of extracted DNA in the leaves ofZizania latifoliawas lower than single stress.The hyperchromicity of DNA had a larger descendent range when treated with combined stress than single stress.Treated with inorganic fertilizer,the amount of extracted DNA in the leaves ofZizania latifoliawas lower than treated with organic fertilizer.The hyperchromicity of DNA had a larger descendent range when treated with inorganic fertilizer than organic fertilizer.The amount of extracted DNA and the hyperchromicity of DNA in leaves of Jiangshu were higher than that of Fenghongzao at the same treatment.

Heavy metal;Combined stress;Amount of extracted DNA;Hyperchromicity of DNA

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.14.014

国土资源部与江苏省政府合作项目[(2003)019-01]，江苏省农业三项工程项目[sx(2005)089]

黄凯丰（1979-），男，博士，研究方向为污染生态，电话：0851-6780646，13608585660。E-mail：hkf1979@163.com

江解增，通信作者

2009-03-12