组合化学的高通量合成策略

段梅莉

【摘 要】本文对一门新兴的用于新药开发的组合化学技术进行了简要的归纳和总结。组合化学的高通量合成策略从合成方法学上归纳为三类方法:平行合成法、裂分合成法、集组式合成。并概括介绍了高通量合成的重要辅助因子固相载体技术和自动化技术。

【关键词】组合化学 高通量合成 新药开发

【中途分类号】O621.3 【文献标识码】A 【文章编号】1673-8209(2009)11-0-03

20世纪80年代末兴起的组合化学技术在新药开发的过程中,在先导物的发现和结构优化上取得了卓有成效的研发结果。组合化学所运用的高通量合成技术与传统的有机合成有显著的不同。如图1所示,一般有机合成方法每次合成得到一个产物。高通量合成技术则是进行组合合成,用一个构建模块A与另一个构建模块B的n个单元同时进行一步反应,可以得到n个产物。用一个构建模块A的m个单元与另一个构建模块B的n个单元同时进行一步反应,则得到m×n个化合物;若进行Y步反应,则得到n×n×Y或m×n×Y个化合物。有人作过统计,一个化学家用组合合成在2～6周完成的工作量,相当于十个化学家用传统方法花费一年时间才能合成得到的化合物数目。由此可见,高通量合成大幅度提高了新化合物的合成效率,减少了时间和资金的消耗,成为继20世纪末至今化学研究的一个热点。

高通量合成可以分为固相组合合成和液相组合合成两大类,组合化合物库也相应的分类为固相库和液相库。因此库化合物的合成策略应当围绕着这二大类组合合成展开进行。高通量合成从合成方法学上来说,可归纳为以下三种方式:平行合成法;裂分合成法;集组式合成。

1 平行合成法(Parallel synthesis)

也称间隔平行式合成。间隔平行式合成的基本原理是一孔一化合物。与传统有机合成的原理相似,通过空间隔开的整齐排列的反应器皿来平行合成化合物。由于在特定区域可得到很纯的化合物,因此化合物结构测定容易,参数相对容易取得。该方法的特点是合成速度较快、化合物数目较大,可用于固相组合合成和液相组合合成中。平行合成法多使用96孔微量滴定板操作。平行合成法已成功用于抗菌化合物和神经激肽-2拮抗剂类似物等化合物库的制备。

当化合物库有许多生物活性化合物供筛选时,使用平行合成法最适合。因为平行合成法合成的化合物是一孔一化合物,单个化合物对新药开发中先导化合物优化和构效关系研究(SAR)特别有价值。平行液相合成和平行固相合成均可快速、高效的合成出对应大量单个化合物的液相库和固相库。固相库的合成产量可以从纳摩尔到毫摩尔不等,一般来说液相库的产量较固相库高。化合物库容量在几千以上时,多采用自动化装置进行合成。

1.1 多针法(Polypin)

也称多中心合成法,它是Geyson教授发明的用于多肽合成的一种96孔微量滴定板反应装置。该装置每孔对应使用长40mm,直径4mm的聚乙烯小棒(针)固定在滴定板上进行操作。每个小棒承载的化合物量在100纳摩尔-50微摩尔不等,可合成超过25mg的产物。这种多针合成反应装置已成功地用于口蹄疫病毒抗原体的免疫学研究上。

多针合成法的具体操作是,将浸在丙烯酸水溶液中的聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)小棒用γ射线照射,使针的表面活化。活化后的针被羧基所覆盖。这些羧基与长链的结合分子连接后,就提供了既能增加反应体系流动性又可以连接构件的氨基基团。把不同的氨基酸溶液反应试剂移到96孔微板的每个孔中,即可对每一根针进行独立的合成反应。在每步反应完成后将小棒移开,在一个公共反应器中对这些小棒同时进行树脂珠的冲洗等纯化操作。重复这些操作直至拿到理想化合物。对应小棒上的目标产物可通过切割分离到滴定板的每个孔中,就使得每个孔均含有一个单独的化合物。使用连在针上的多肽进行生物活性测定时,可与多种靶分子进行结合试验,操作可反复进行多达几十次。

多针合成法是一种有效平行合成多肽的方法,尤其是以羧基或酰胺结尾的多肽。该法也可用以合成苯并二氮杂窧类有机小分子化合物库。目前该技术正向着高负载量、多种官能团化的固相载体材料以及多样性丰富的化学反应方向发展。在先期为抗原位点研究进行的多肽合成中,多针合成法产生了非常大的影响,已成为最有价值的组合化学合成技术的标志。

1.2 茶叶袋法(Tea-bag)

茶叶袋法是Houghten教授1986年发明的一种组合合成技术。该技术自使用以来,对探明激素分子活性片段有关的构效关系研究、对蛋白质片断构象的探察以及对RGD肽类似物的深入研究都显示了很大的功效。

该方法的固相载体为常见的Merrifield聚苯乙烯树脂,反应容器为化学惰性的多孔PE小袋,袋子的大小尺寸约为15mm×22mm,茶叶袋网眼74um,可防止树脂珠漏出,保证溶剂等可溶性物质的出入。为了高通量合成大容量的多肽库,节省时间和工作量,在相同的化学反应步骤中,每一个反应器内可容纳多个袋子,同时进行相同的反应,集中进行洗涤、脱保护和中和。再集中切除树脂珠。根据茶叶袋的尺寸和树脂珠的质量,化合物库每个产物的产量大约为7-15mg,多的可达100mg。使用这种集中进行共同反应步骤的方法,在制备肽库时大大提高了合成效率,使之成为组合合成的典型范例。

1.3 点阵法

该法是以纤维素纸片作为固相载体的合成技术。以纤维素为基质的纸片具有多孔性和极性,可在筛选时避免出现非特异性蛋白结合的副作用。但其缺点是不耐受强酸环境,仅适合Fmoc保护方式的构件。该合成反应操作简便,虽无制备意义,但其合成技巧可以与嫁接多针扫描法及超大规模固定化多肽合成技术相媲美。点阵法多肽库的合成已用于对人体巨细胞病毒蛋白抗原决定簇的定位试验。

点阵法斑点合成技术操作是,控制所用试剂的体积,选择斑点的位置,使斑点布满一张纸面而又不发生重叠。这些斑点对应不同的多肽,可以用铅笔标记斑点。将结合分子接到纸上后,对每个斑点滴加相应高浓度的氨基酸活化酯溶液,经洗涤-脱保护-再洗涤处理,完成一个构件的缩合。如此反复操作进行多肽的合成。用溴酚蓝指示剂给纸片染色,通过观察由蓝到黄的颜色变化(游离的氨基被酰化)来跟踪反应进程。

1.4 光印法(Light-directed parallel synthesis)

也称超大规模固定化多肽合成(very large scale immobilized peptide synthesis, VLSIPS)。光印法是将固相合成技术与光敏式印刷技术结合为一体的一种高通量合成方法。它是平行合成中较为特殊的一种方法,其关键技术是对光不稳定的保护基通过特殊位置的光照会选择性的断裂。该法可以在一张50um2的玻璃载片上合成出容量高达5万的多肽或寡聚核苷酸的化合物库。并且每种特定产物序列占据空间的一个特定区域。由于筛选是连在载体上进行,经荧光显色筛选识别出有生物活性化合物的结构,可由其所在位置得到确认,合成十分精确。该合成技术已用于内啡肽的抗体合成筛选试验。

2 裂分合成法(split-poll synthesis)

亦称混合-裂分式合成、一珠一化合物(one-bead one-product, OBOP)。裂分合成法是最早也是至今应用最广泛的一种高通量组合合成技术。该法只需几个反应器即可构成一个容量庞大的化合物库,是合成大量不同化合物最常用的方法。裂分合成技术为药物先导化合物的发现提供了充足的化合物资源,改变了传统的单一合成/单一筛选的药物研究格局。

裂分合成法只需几个反应器就可以产生一个化合物库,图2例示了三个构建单元通过三步反应的裂分合成。具体操作是,将固相载体树脂珠分成数目相等的三部分,每一部分放在单独的反应器中,各部分独自与不同的构建单元A、B和C反应,这样每一个树脂珠就连接上了一个构建单元。当第一步反应完成后,将每个反应器中的树脂珠分成数目相等的三部分,并混合每一个反应器中的树脂珠成均等的三部分,尔后集中在一个器皿中进行常规的冲洗和脱保护程序。然后将每一部分树脂珠放在单独反应器中独自与不同的构建单元A、B和C反应,这样每一个树脂珠就连接上了第二个构建单元。如此反复直至库容量达到了33=27个化合物。

裂分合成法合成的特点是OBOP,即每一个树脂珠都连有一个单独的化合物。因此,该法的组合化合物库又称为一珠一化合物库。裂分合成法制得的化合物库中产物的数目以几何级数增长,N=bx(N为库容量;b为构建单元数;x为合成步骤数)。

用高效的编码技术辅助进行裂分合成时,可以几个小圆柱形反应器为混分操作的基础单元,每一个反应器由微孔外壁将几百粒树脂珠和射频记录片包在其中,在合成反应进行的同时输入该构件单元的射频信号。因此合成完成后,通过解读记录片上的信号即可识别反应器内连在树脂珠上的产物结构信息。每一个反应器内的所有树脂珠上均连着同一产物,这样得到的化合物库称其为一反应器一化合物库,即OVOP(one-vessel one-product)库。

裂分合成法合成的库化合物的生物活性筛选可以直接用树脂珠上的化合物测试活性,更可靠的方法是用固相载体上切下的混合物溶液来测试。解缠绕过程是常用的一种对混合裂分合成化合物库进行生物活性筛选的方法和手段。

3 集组式合成(pooling synthesis)

也称混合试剂合成法。集组式合成的特点是对全部构件进行有序排列并按一定形式编组。每一组含有多种不同的构件,一组作为一种构建单元投入合成。库化合物组合合成的每一步反应都是在构建单元混合物的反应器皿中进行。固相集组式合成得到的不是一珠一化合物库,而是一珠一组甚至是一珠多组化合物库。液相集组式合成得到的化合物库,可以按组分布,每一组均含多种化合物。不管是固相库合成还是液相库合成,两者都需要高效的编码技术辅助进行,以备在其后的生物筛选中它们的结构信息得到及时的识别。

集组式合成可归纳为正交编组法、索引编组法以及模板核心法三种形式的操作过程。集组式合成是发现药物先导化合物最经济的方法。该方法实验设备要求低,不必逐一合成组合库中各个单组分,一般的实验室即能进行合成操作。虽然该法简易可行,但缺点也明显,即组分越多,分析跟踪及产物结构识别的难度越大。

4 固相载体技术

固相合成技术是高通量合成的核心内容,该技术从20世纪60年代被Merrifield创造性地成功合成多肽以来,便得到了极大的重视。在国际医药企业的合力运作下,1990年代至今固相合成技术得到了蓬勃发展,基本形成了固相有机合成化学的独立学科。而且固相合成技术远未成熟,被认为仍有极大的发展空间,现在的成果只是金山一角。有统计表明,与有机化学相关的排名前15位的国际期刊几乎每一期均刊登与固相有机合成相关的论文。固相合成技术最基本的构成要素就是固相载体。因此固相载体技术可以说是固相库合成的基石。

4.1 功能树脂

固相载体是在各种溶剂中不溶解但可溶涨的高聚物材料,即功能树脂。高通量合成要求载体具有一定的化学稳定性和机械强度;能够与结合分子相连,但对库合成中使用的反应条件惰性,在需要时随时方便断开;能够在结合分子上延续化合物的制备,延续的合成步骤不破坏载体,也不影响其它化学键。

随着高分子材料的发展,基于交联聚苯乙烯(PS)的高强度Merrifield树脂、在极性非质子溶剂中溶解度高,官能团保护、脱保护和切割条件更加温和的聚酰胺树脂以及可在水相中进行合成、对酶学研究意义重大的TentaGel(PS-PEG copolymer)树脂等各类功能性树脂材料被先后开发出来。任何功能树脂均可以按合成的要求制成固相载体。固相载体从外形上可以分为树脂珠、多针和薄片。

4.2 树脂珠技术(bio-bead)

绝大多数的固相库合成是通过树脂珠技术来实施的。1g树脂可以制成几百万个树脂珠,按照“三倍多余”的原则,可以构建一个10万个产物的化合物库。每个树脂珠的直径大约为100?m,可承载200pmol的化合物。树脂珠的制备方法是,向单体有机相和交联剂的混合水溶液中加入自由基引发剂,升温启动聚合反应,将微小液滴转变为固体球状小珠子颗粒。其聚合反应的要点是保证小珠体积均一。运用平行合成法、裂分合成法进行的组合合成均可得到每一个树脂珠都连有一个单独化合物的一珠一化合物库,即OBOP(one-bead one-product)库。

4.3 薄片技术(thin tag)

任何一种能在树脂珠上进行的化学反应均能在薄片上实施合成反应。用PS树脂制成的形似小饼干的薄片(chip),如四边形、三角形、圆形、五角形和六角形的小薄片,它们有一定的强度和许多微孔,且有良好的溶胀性。由于较大的表面积,产物的上载量远远大于一粒树脂珠,因此较有制备意义。运用裂分合成法组合合成可得到每片薄片上有一种产物的化合物库,即OCOP(one-chip one-product)库。

基于纸片的薄片可作为点阵法平行合成的载体。而基于玻片的薄片可作为光印法平行合成的载体。

4.4 固相膜技术

基于高聚物的薄片比纸片的化学性质更稳定,因而可以承受更宽的化学反应条件范围。聚氟乙烯膜制成的高聚物薄片的点合成,其合成方法与纸片斑点技术相似,将膜表面用乙二胺衍生化后,便提供了带有氨基的活化基团表面。将有Fmoc保护的丙氨酸活化酯溶液以规则的空间排布方式点到固相膜上,就得到了用于多肽合成的斑点。在点合成偶联步骤之间,膜可被多次晾干-洗涤-再晾干,用哌啶溶液脱Fmoc保护,多肽的多种产物就集合在一张薄片上。

还有一种固相膜三明治合成技术,是将两张PP小片夹住树脂珠,像三明治一样,用一种低熔点的聚合物使珠子在膜操作及整个合成步骤中固定不动。运用裂分合成法组合合成可得到每张层状载片上有一种产物的化合物库,即OSOP(one-slide one-product)库。由于每一张层状载片上含有许多树脂珠(可达几千粒),则每一种产物的量相对较高,因此OSOP库合成具有制备意义,比OBOP库合成实用性高。

5 自动化合成技术

随着生物化学技术的高速发展,每天可筛选上万个化合物生物活性的高通量筛选技术已经被广泛运用。当组合化合物库容量达到上千的规模时,在有限的时间里,完成人工合成和对生物靶点的筛选是一项十分艰巨的工作。因此库化合物的自动化高通量合成技术便应运而生,可以说这是为了跟上高通量筛选的步伐,而产生的一种快速、高效的合成技术。与该技术相配合,需要机器来完成的操作有,树脂珠装载、试剂的转移、合成条件的控制、合成反应的进行、化合物的分离、纯化和结构分析以及树脂珠的切割等。显然自动化高通量合成技术是一项繁杂有序的过程工程,它将有机化学、计算机技术以及信息和电气自动化技术等多学科集于一体。

组合化学需要合成大量毫克级量的化合物来筛选。该特点使得利用高效小型机件和器械来处理大量样品,成为节约省时最基本的前提。固相库的平行合成法组合合成是自动化高通量合成技术取得成功运营的一个范例。滴定机器人等自动化机件被广泛的使用在许多合成操作上。已知多肽和核酸的组合合成,目前已经完全可以用自动平行合成仪来进行操作。但是自动化高通量合成技术水平仍然低于发展较为完善的高通量筛选。平行合成自动仪每天约产生1000～2000个化合物,而微量滴定板上的高通量筛选,可对特定的生物受体每天筛选1～5万个化合物。

绝大多数的高通量合成是在10mg、10-20umol数量级的微反应系统内进行。微反应器的普遍使用给组合合成和筛选策略带来了根本的改变。微反应器联通了合成和筛选的直接整合,也提供了发现新药化合物的更好方法。微反应器与微尺度纯化和高灵敏度分析设备紧密相连,毫微托板用于从微流量分离单元中直接收集样品,直接转移到生物分析单元。这样整合的成套设备,使化合物合成后就用来筛选,设备中没有储存系统。

6 结束语

以上对新兴的用于新药开发的组合化学技术进行了简要的归纳和总结。组合化学的高通量合成策略从合成方法学上可以归纳为三类方法:平行合成法、裂分合成法、集组式合成。本文还概括介绍了高通量合成的重要辅助因子固相载体技术和自动化技术。相信在不久的将来,最早用于新药开发的高通量合成技术在我国相关的研发领域能得到较大的普及应用。

参考文献

[1] 吉民.组合化学,北京:化学工业出版社,2004.

[2] 王德心.固相有机合成,北京:化学工业出版社,2004.

[3] 王德心..组合化学原理、技术及应用,北京中国协和医科大学出版社,2005.

[4] Willi Bannwarth, et al, Combinatorial Chemistry, Weinheim, WILEY-V.