桃褐腐病抗性鉴定技术与应用

薛璐 杨英军 李勇

摘 要：桃褐腐病是果树上的常见病害，给桃树生产造成巨大损失。发掘抗褐腐病种质资源，培育抗病品种在桃生产中具有重要意义。研究建立了桃褐腐病离体鉴定技术规程，包含菌种获得、菌种鉴定、人工接种、抗性鉴定等主要技术关键点，并应用于105份桃种质资源的抗褐腐病鉴定，发现褐腐病抗性呈现正态分布，抗性较强的有11份种质。

关键词：桃褐腐病；抗性；种质资源；鉴定技术

作为桃树上常见的重要病害，桃褐腐病从果实幼果至成熟期间均有可能发生，其对果实的危害最为严重。成熟期和贮藏期的果实受害最为严重，此外贮藏期烂果还会导致严重的经济损失。选取杀菌剂防治果树褐腐病在果树生产中是最高效的方法，因其低毒害、高效率的特点而得到大众认可。但随着时间的推移，在实践中也暴露出一些缺点，其作用的机制专一，长期使用杀菌剂会使田间植物的病原菌产生抗性，并且对田间环境也会产生影响。因此，筛选抗褐腐病桃种质、培育抗褐腐病桃新品种是桃育种过程中的重要突破点。

1987年，巴西最早开始人工接种并筛选抗性种质，Bolinha[1]为第一个筛选出具有桃褐腐病抗性的品种。之后巴西利用具有褐腐病抗性来源的Conserva 672、Bolinha等材料作为亲本培育了3个杂交组合，筛选了12株对褐腐病抗性表现较强的单株[2]。2022年，沈志军等[3]利用616份桃资源进行褐腐病抗性鉴定，筛选出10份抗侵染能力较强的种质资源。用抗性材料作为育种亲本是培育抗褐腐病品种的有效办法。笔者在本研究中针对国家园艺种质资源库郑州桃圃的优势菌株，参考前人鉴定流程并作出修改，形成桃种质资源的鉴定技术，有效推进桃褐腐病抗性育种的进程。

1 桃褐腐病病原菌的分离与鉴定

1.1 材料

于国家桃种质资源库郑州桃圃采集具有桃褐腐病典型特征的病果。

1.2 褐腐病病原菌分离鉴定

1.2.1 病原菌的分离与纯化 在桃园中寻找带有褐腐病特征的桃样品，放置在取样袋中，带到分子实验室做病原菌的分離工作。方法如下：从褐腐病病果中挑取霉菌孢子，选取单孢分离法[4]分离病原菌。使用灭过菌的针头从果实发病部位边缘挑取较新鲜的分生孢子堆，并将其接种于PDA培养基（配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，水1000毫升，自然pH值。培养基灭菌条件为121 ℃ 30分钟高压蒸汽灭菌）上，于22 ℃全黑暗霉菌培养箱倒置培养。待褐腐病原菌菌落生长出菌丝，于菌丝外缘位置取少量，接种至新的培养基。经过3代的分离和纯化，获得褐腐病病原菌株。

1.2.2 病原菌的形态学鉴定 分离与纯化后的病原菌株接入PDA培养基，在全暗霉菌培养箱放置5天，观察其形态，并利用显微镜查看分生孢子和分生孢子梗的形态。菌落在培养基上的特征为：菌落边缘相对整齐，颜色呈现灰黄色（图1-A）；菌落的背面边缘为浅灰色，中间为深色（图1-B）；图中的分生孢子梗呈现串珠状，为不分枝或呈现二叉状分枝，且为锐角（图1-C）；分生孢子为无色单孢，为卵圆形（图1-D）。根据魏景超[5]的《真菌鉴定手册》和Lane[6]的褐腐病病原菌的形态学鉴别方法，把测定菌株鉴定为Monilinia fructicola。

1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定 将菌株在PDA平板上活化5天，用灭过菌的枪头刮下菌丝，置入2毫升离心管中，加入小钢珠，在液氮中速冻后用磨样机研磨。使用真菌DNA提取试剂盒（OMEGA试剂盒）提取病原菌基因组，并将DNA储存于-20 ℃冰箱备用。采用真菌rDNA ITS通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）进行菌株ITS序列测定，扩增使用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系（25微升）如下：2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus） 12.5微升，DNA模板1微升，引物1（F）0.5微升，引物2（R）0.5微升，ddH2O 10.5微升。PCR反应条件为：95 ℃3分钟，95 ℃15秒，58 ℃20秒，72 ℃ 60秒，共30个循环；72 ℃5分钟。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察到明亮目的条带后，将产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。将测序得到的序列与NCBI中已知基因序列进行BLST同源性检索，并下载与测定菌株相似度超过99%的部分桃褐腐病病原菌株的基因序列。采取最大似然法和邻接法，用MEGA10.0软件构建系统发育树。经测序得到大小约500 bp的ITS片段序列，基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树结果表明，笔者在本研究中鉴定的桃褐腐病病原菌菌株与Monilinia fructicola（GenBank 登录号为 MZ047241.1）聚在一个分支上，二者相似度高达99%，因此测定菌株被鉴定为Monilinia fructicola（图2）。

2 桃褐腐病抗性鉴定技术

2.1 病菌的培养

纯化后的病菌使用滤纸片保存在超低温冰箱，接种前20天使用PDA培养基活化培养。用PDA培养基进行菌种的扩繁，菌块接种完成后，将其放到22 ℃的全暗霉菌培养箱，5天后备用。抗性鉴定参考前人的方法[7-8]，并作调整。挑取菌株的少量新鲜分生孢子的菌块，用无菌水（含0.01%吐温20）冲洗菌块，用高级擦镜纸进行过滤，最大限度地减少菌丝碎片，从而得到分生孢子悬浮液。用显微镜与血球计数板观察分生孢子状态，并将分生孢子悬浮液的浓度调整为2×105个/毫升，用于桃果实接种。

2.2 果实采收与筛选

采收成熟度为八成，每份种质采20～25个果实。采收后立即运回控温实验室（24±1 ℃），平衡果实温度4小时以上，选择无病虫害、无损伤，并且成熟度一致的桃果实，用于褐腐病抗性接种鉴定。采收桃果实需避开雨天。

2.3 接种鉴定

准备透明塑料筐3个（尺寸为380毫米×250毫米×200毫米），底部铺双层吸水纸，倒入100毫升无菌水润湿吸水纸，均匀放入18个培养皿（每个塑料筐可放6个培养皿），每个培养皿内放1个垫圈，再放18个桃果实（12个用于接种，6个作为对照）。用小量程的移液枪吸10微升分生孢子悬浮液，滴向桃果实的侧面中央部位，对照组则滴加等量无菌水。接种后的果实置于透明塑料筐中，盖上筐盖，保持湿度90%～95%。在（24±1）℃、光暗交替（光照12小时和黑暗12小时）的环境中培养，每天调查并记录病果数量和病斑直径。参考许志刚[9]的方法，将桃发病情况分为9级（表1），依据病果数计算各种质接种褐腐病后的病情指数，病情指数=100×∑（各级发病果数×病级）/（果实总数×最高发病级数）。

3 桃褐腐病抗性鉴定技术应用

根据上述桃果实褐腐病抗性鉴定技术，鉴定了105份桃种质。由图3可知，依托褐腐病抗性调查计算出的病情指数基本呈现正态分布。抗病与感病品种的鉴定结果图举例如下（图4），如图所示，在第7天时，感病种质有2/3的果实被大面积侵染，而抗病种质未发现被侵染。

褐腐病样本的调查统计如表2所示，结合105份桃种质资源病情指数的聚类分析，将桃种质对褐腐病病原菌的抗性划分为5类：高抗HR、抗病R、中抗M、感病S、高感HS。

4 讨论与结论

桃褐腐病为桃果实中的常见病害，会出现于桃生长发育的各个阶段，对果实的影响最为严重，研究桃种质对褐腐病的抗病感病情况尤为重要。目前对桃褐腐病离体接种的系统研究较少，本研究结合了前人研究方法，并将其完善。从105份桃资源中筛选的高抗种质可作为抗性育种的亲本，进而加速桃褐腐病抗性育种进程。

通过调查105份桃褐腐病样本的抗病感病情况，发现对褐腐病抗性表现较强的有11份种质，占测定种质资源的10.5%。桃褐腐病鉴定技术为桃褐腐病抗性育种奠定了一定的基础。

参考文献

[1] FELICIANO A， FELICIANO A J， OGAWA J M. Monilinia fructicola resistance in the peach cv. Bolinha[J].Phytopathology， 1987， 77： 776-780

[2] SANTOS J， RASEIRA M C B， ZANANDREA I. Resistance to brown rot in peach plants[J]. Bragantia， 2012， 71（2）： 219-225.

[3] 沈志军，田雨，蔡志翔，等.基于国家果树种质南京桃资源圃的桃褐腐病抗性评价[J].中国农业科学，2022，55（15）：3018-3063.

[4] 纪兆林， 张建军， 徐敬友， 等. 抗腐霉利的灰葡萄孢菌株特性及其竞争能力[J]. 扬州大学学报（农业与生命科学版）， 2007，（2）： 65-68.

[5] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1979.

[6] LANE C R. A synoptic key for differentiation of Monilinia fructicola， M. fructigena and M. laxa， based on examination of cultural characters[J]. EPPO Bulletin， 2002， 32（3）： 489-493.

[7] MARTINEZ-GARCIA P J， PARFITT D E， BOSTOCK R M， et al. Application of genomic and quantitative genetic tools to identify candidate resistance genes for brown rot resistance in peach[J]. PLoS One， 2013， 8 （11）： e78634.

[8] OBI V I， BARRIUSO J J， MORENO M A， et al. Optimizing protocols to evaluate brown rot （Monilinia laxa） susceptibility in peach and nectarine fruits[J]. Australasian Plant Pathology， 2017， 46（2）： 183-189.

[9] 許志刚．普通植物病理学[M].４版.北京：高等教育出版社，2009．