不同消毒方式对特殊药材连作土壤理化性质、酶活性及微生物群落的影响

高正睿 宿翠翠 王玉红 张兆萍 施志国 魏玉杰

关键词：土壤消毒；连作；土壤酶活性；土壤微生物群落；特殊药材

特殊药材作为传统的中药饮片，含有多种生物碱，具有很高的药用价值。近年来，随着特殊药材连作年限的增长，土壤中病原菌逐年累积，从而加重了土传病害的发生，导致产量和品质严重下降，制约了特殊药材产业的发展。目前消减药用植物连作障碍的方法主要有土壤消毒、微生物调控、选育抗病品种、合理施肥、轮作倒茬等，其中，土壤消毒是防治土传病害的重要途径，可以快速、高效地缓解作物连作障碍问题。

在所有的土壤熏蒸剂中，溴甲烷的消毒效果最好，但由于其对臭氧层的破坏作用而被禁用。目前研究较多的溴甲烷的替代产品有棉隆、石灰氮等。棉隆是一种低毒的土壤熏蒸剂，在湿润的土壤中可以分解成异硫氰酸甲酯（methyl-isorhodanate，MITC），对微生物、杂草、线虫都有良好的杀灭效果。胡洪涛等研究发现，棉隆消毒土壤对甘蓝根肿病有较好的防治效果，可显著提高其产量；曹世勤等研究发现，使用棉隆颗粒剂处理土壤，可以有效控制小麦田土传病害，且具有一定增产作用。石灰氮在土壤中水解后可以生成氢氧化钙和氰氨，后者能有效杀灭病原微生物。孟思达等研究表明，施用石灰氮可以改善土壤酸化程度，中剂量的石灰氮可显著提高番茄产量，改善果实品质；张学鹏等研究表明，施用石灰氮可提升黄瓜连作土壤中的有机质含量，提高土壤脲酶、过氧化氢酶活性，从而改善土壤环境。

尽管土壤消毒可有效消除土壤中的病原微生物，但也会杀灭土壤中的其他微生物，造成土壤生态系统失衡。因此，消毒后及时补充土壤有益微生物，是保持土壤微生态平衡、防治病虫害复发的最佳措施。众多研究表明，对土壤进行消毒处理和微生物菌剂联用能有效控制作物土传性病害的发生，如西瓜枯萎病、茄子黄萎病等，而在药用植物土传病害防治方面的相关研究较少。

因此，本文从调节土壤微生态环境角度出发，研究土壤消毒、土壤消毒剂与微生物菌剂联用对特殊药材连作土壤理化性质及土壤酶活的影响，并采用高通量测序技术评价不同消毒方式对土壤根际微生物群落结构的影响，为克服特殊药材连作障碍提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验区概况

试验地位于平原和沙漠戈壁边缘交汇地带，平均海拔1780m，多年平均降水量约200mm，年蒸发量约2700mm，年均日照时数2825.2h，年平均气温约7.5℃，土壤为灌漠土。

1.2试验设计

消毒剂选用98%棉隆微粒剂，购自台州市大鹏药业有限公司；氰氨化钙（石灰氮颗粒剂），购自宁夏远大兴博化工有限公司：“金禾苗”微生物菌剂（用水稀释200倍使用），购自黑龙江田之源农业科技开发有限公司。

试验于2022年3月开始，共设6个处理：T1（棉隆300kg/hm2）、T2（棉隆300kg/hm2+微生物菌剂1.5L/hm2）、T3（石灰氮1500kg/hm2）、T4（石灰氮1500kg/hm2+微生物菌剂1.5L/hm2）、T5（微生物菌剂1.5L/hm2）、CK（清水），每处理重复3次。

1.3消毒剂施用和土壤采样方法

试验地为连续种植特殊药材3年的重茬地。施用消毒剂前，用旋耕机翻耕土壤。将消毒剂均匀撒施于地表，用旋耕机将其与土壤混合均匀，混土深度不低于30cm。消毒剂施用后进行灌水并用塑料薄膜覆盖土壤30d。30d后将塑料薄膜移开，将土壤透气30d。种植前重新翻地，所有处理施肥及其他田间管理措施保持一致。于开花期采集根系土壤，每个处理随机选取10株特殊药材，收集根系表面0～5mm的土壤，混合均匀，一部分于-80℃冷冻用于DNA提取，一部分用于土壤理化性质测定。

1.4测定指标及方法

土壤理化性质：土壤pH值、有机质、水解性氮、水溶性盐、有机磷、速效钾、全氮、全磷等指标根据鲍士旦的方法进行分析测定。

土壤酶活性：土壤脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、中性磷酸酶活性采用南京集测生物科技有限公司提供的试剂盒测定。

土壤微生物多样性：采用土壤DNA抽提试剂盒（HiPure Soil DNA Kit B，Magen公司）对DNA进行提取。琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测合格后用于PCR扩增。提取样品的总基因组DNA后，对细菌16S RNA的V3～V4区以及真菌的ITS区域进行扩增，正向引物分别为CCTACGGGNGGCWGCAG和CTTGGTCATTTAG-AGGAAGTAA，反向引物分别为GGACTACHVG-GGTWTCTAAT和GCTGCGTTCTTCATCGATGC。利用Illumina Novaseq 6000平台进行测序，测序得到的数据通过拼接，得到较长序列后进行分析。上述过程均委托南京集思慧远生物科技有限公司完成。

1.5数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2019对试验数据进行整理，用SPSS软件进行方差分析，数据用“平均值±标准误”表示，采用Duncan法进行差异显著性分析（P<0.05）。使用软件pandaseq，根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，使用软件PRINSEQ，过滤read尾部质量值20以下的碱基，过滤掉N长度占序列总长5%的序列，通过QIIME2软件进行物种注释。

2结果与分析

2.1不同消毒方式对土壤理化性质的影响

不同消毒方式处理后土壤各理化性狀指标见表1。结果显示，与CK相比，消毒处理显著提高土壤有机质含量，T1-T5分别增加21.64%、18.27%、27.28%、12.69%、17.90%，各处理间差异显著；土壤速效钾含量，T1、T5处理后无显著变化，石灰氮消毒和石灰氮配施微生物菌剂（T3和T4）处理后分别增加26.71%和16.34%：T1处理后土壤水解性氮含量显著降低了12.66%，而T3和T5处理显著增加，增幅分别11.68%和13.06%；T5处理显著增加土壤全氮含量；T2（棉隆+微生物菌剂）、T3和T4处理后土壤有效磷含量分别显著增加28.82%、25.24%和16.74%；土壤水溶性盐含量，T3处理显著增加，T5处理显著降低；各处理土壤pH值和全磷含量较CK均无显著差异。

2.2不同消毒方式对土壤酶活性的影响

经过不同消毒方式处理后的土壤酶活性如表2所示，与CK相比，棉隆消毒和棉隆配施微生物菌剂处理（T1和T2）显著降低了土壤脲酶活性，降幅分别达15.29%和9.70%，石灰氮、石灰氮配施微生物菌剂和微生物菌剂处理（T3、T4和T5）土壤脲酶活性均显著增加，增幅分别达29.66%、28.65%、43.83%；T4处理土壤过氧化氢酶活性显著降低11.95%；T1、T2、和T3处理均显著降低了土壤蔗糖酶活性，降幅分别为24.69%、25.84%和31.99%，而T4和T5处理显著增加其活性，增幅分别达5.370-/0和8.69%：T2和T3处理显著降低土壤中性磷酸酶活性，降幅分别为16.30%和21.74%，T4和T5处理均显著增加其活性，其中微生物菌剂处理（T5）增幅达到10.33%，表明微生物菌剂处理有助于土壤中有机磷的分解转化。

2.3土壤化学性质与土壤酶活相关性分析

由Pearson相关性分析结果（表3）可知，土壤脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性与pH值均无显著相关性；土壤脲酶与速效钾含量呈显著正相关（P<0.05），与全氮、水解性氮含量呈极显著正相关（P<0.01）；土壤蔗糖酶与全氮呈显著正相关（P<0.05），与有效磷含量呈显著负相关（P<0.05），与有机质和水溶性盐含量呈极显著负相关（P<0.01）；土壤中性磷酸酶与水溶性盐、有效磷呈极显著的负相关性（P<0.01），表明低的有效磷含量对其具有激活作用。

2.4不同消毒方式对土壤微生物多样性及群落结构的影响

2.4.1不同消毒方式对土壤微生物a-多样性指数的影响

不同消毒方式对特殊药材连作土壤微生物群落多样性存在差异（表4）。由表4可见，各处理土壤细菌和真菌物种覆盖度指数（Cover-age）均在0.99以上，且各处理间差异不显著，表明测序结果能够较全面地反映土壤细菌和真菌的丰富度。不同消毒方式处理的土壤细菌Chaol、Ace和Shannon指数均显著（P<0.05）高于对照，且Chaol和Ace指数均以T1处理最高。表明不同消毒方式处理均可显著提高土壤细菌丰富度与多样性，而土壤细菌Simpson指数与对照差异均不显著。T2、T4和T5的土壤真菌Chaol、Ace指数均显著（P<0.05）高于对照组，T2、T3、T4和T5的Shannon和Simpson指数均显著（P<0.05）高于对照，T1处理的Shannon和Simpson指数与对照差异不显著，土壤真菌Chaol、Ace、Shannon、Simp-son指数均以T5处理最高。表明微生物菌剂和土壤消毒剂配施微生物菌剂处理可显著提高土壤真菌丰富度与多样性。

2.4.2不同消毒方式对土壤微生物门水平上相对丰度的影响从图1A可以看出，在门水平上，不同消毒方式处理土壤样本中检出10个细菌门，占总丰度的93.80%～97.05%，分别为变形菌门（Proteobacte-ria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、芽单胞菌门（Gem-matimonadota）、浮霉菌门（Planctomycetota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、粘球菌门（Myxococcota）、甲基甲酰胺门（Methylomira-bilota）。变形菌门的相对丰度排序为：T1>T2>T3>T4>CK>T5，T1较CK提高了20.99%；酸杆菌门的相对丰度排序为：T3>CK>T2>T5>T4>T1，T1较CK降低了18.68%：芽单胞菌门的相对丰度则是CK最高，与CK相比，T1和T5分别降低了22.06%和21.09%：浮霉菌门的相对丰度排序为：T5>T2>T4>CK>T3>T1，T5比CK提高了13.35%：绿弯菌门相对丰度在T4和T5处理土壤中显著高于CK;拟杆菌门和疣微菌门各处理相对丰度与CK差异均不显著，放线菌门的相对丰度降低。

不同消毒方式处理土壤样品真菌在门水平上的相对丰度如图IB所示，丰度前3的优势菌门分别为子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomy-cota）、担子菌门（Basidiomycota）。其中，子囊菌门的相对丰度排序为：T3>T5>T4>CK>T2>T1．T3和T5处理分别较CK提高23.01%和17.75%，；接合菌门的相对丰度以CK最高．T4和T1處理分别较其降低82.94%和69.92%：担子菌门的相对丰度排顺序为：T1>T2>T5>T3>CK>T4，T1、T2、T5处理均显著高于CK；其他类群中，壶菌门（Chytridiomy-cota）相对丰度以T5处理最高，罗兹菌门（Rozello-mycota）以CK最高，均显著高于其他处理。

2.4.3不同消毒方式对土壤微生物属水平上相对丰度的影响

如图2A所示，属水平上，除其他菌属（49.58%～61.64%）外，土壤细菌丰度前10的优势菌属分别是：鞘氨醇单胞菌属（Sphin-gomonas）、WD2101-soil_group、RB41、V1clnami-bacteraceae、MNDI、溶杆菌属（Lysobacter]、S0134_terrestrial_group、马赛菌属（Massilia）、假单胞菌属（Pseudomonas）和Subgroup _7。鞘氨醇单胞菌属相对丰度排序为：T3>T4>T5>CK>T1>T2，T3、T4和T5处理均显著高于CK，T3和T4处理分别比CK提高了59.10%和13.01%：RB41相对丰度排序为：T3>CK>T2>T5>T1>T4，T3较CK提高了7.39%；Vicinamibacteraceae相对丰度排序为：T5>CK>T3>T2>T4>T1，T1处理较CK降低了33.96%：溶杆菌属相对丰度以CK最高，且显著高于T2、T4和T5处理，T4和T5分别较CK降低了54.18%和54.49%；S0134_terrestrial_group相对丰度排序为：T3>CK>T5>T2>T4>T1，T3处理较CK显著提高了26.01%；WD2101_soil_group和MNDI在各处理间差异均不显著；T5处理的马赛菌属较CK显著提高了111.57%：T3和T5处理的假单胞菌属分别较CK显著降低了53.79%和33.41%：T2、T3和T4处理的Subgroup_7均显著高于CK，T2和T3处理分别比CK提高了25.45%和40.69%。

如图2B所示，在属水平上，除其他菌属（31.40%～64.77%）外，土壤真菌的优势菌属主要是被孢霉属（Mortierella）、亡革菌属（Thanatepho-rus）和链格孢属（Alternaria）。其中，被孢霉属的相对丰度以CK最高，显著高于其他处理，T1和T4处理分别较CK降低了70.10%和83.40%：亡革菌属相对丰度排序为：T1>T2>T5 >T3>CK>T4，T1和T2处理显著高于CK;链格孢属的相对丰度排序为：T1>T3>T5>T2>T4>CK，T1、T3、T5处理均显著高于CK，T1和T3分别比CK提高409.36%和145.78%；毛壳属（Chaetomium）相对丰度排序为：T3>T5>T4>T2>CK>T1，T3、T4、T5处理均显著高于CK．T3和T5处理分别比CK提高了168.48%和80.02%；赤霉属（Gibberella）的相对丰度大小顺序为：T3>T4>T2>CK>T5>T1，CK显著高于T1处理；T4和T5处理的金孢子菌属（Chrysospo-rium）分别比CK显著提高了46.37%和572.41%：T3和T4处理的脉孢菌属（Neurospora）分别比CK显著提高了56.80%和69.96%；T3和T5处理的镰刀菌属（Fusarium）分别比CK显著提高了47.22%和113.16%；所有处理的枝顶孢属（Acremonium）均显著高于CK；T2的土赤壳属（Ilyonectria）较CK显著提高了30.92%。

2.5土壤微生物群落PCoA分析

细菌群落PCoA分析结果如图3A所示，PC1与PC2对样本组成差异的解释度分别为20.42%和18.64%，2个主坐标累计解释度达39.06%，PC1可将T5处理的细菌群落与其他处理明显分开，PC2可将T1的细菌群落与CK、T2、T3、T4明显分开，说明T5与其他处理在细菌群落结构上存在显著差异，而T1与CK、T2、T3、T4存在显著差异。

真菌群落PCoA分析结果如图3B所示，PC1与PC2对样本组成差异的解释度分别为37.88%和23.78%，2个主坐标累计解释度达61.66%，各处理间差异较大．但PC1可将T1与CK明显分开，说明T1与CK在真菌群落结构上存在显著差异。

2.6环境因子对土壤微生物群落的影响

细菌群落RDA分析结果如图4A所示，RDAI排序轴解释贡献度为67.78%，RDA2排序轴解释贡献度为13.63%，二者累计贡献度为81.41%。土壤细菌群落主要受土壤pH值、有效磷、水溶性盐、全氮、水解性氮含量的影响。其中，Proteobac-teria与有机质和水溶性盐呈正相關，与其他环境因子呈负相关；Actinobacteriota、Planctomycetota、Chloroflexi、Myxococcota与pH值、全氮、水解性氮呈正相关，与其他环境因子呈负相关：土壤速效钾、有效磷、全磷、水解性氮是影响Methylomira-bilota、Gemmatimonadota、Acidobacteriota的主要环境因子；Bacteroidota、Verrucomicrobiota与有机质、水溶性盐、速效钾、有效磷呈正相关，与其他环境因子呈负相关。

真菌群落RDA分析结果如图4B所示，RDA1排序轴解释贡献度为75.78%，RDA2排序轴解释贡献度为18.81%，二者累计贡献度为94.59%。土壤真菌群落主要受土壤水解性氮、有机质、pH值、全氮、速效钾含量的影响。其中，Zygomycota与全磷、pH值、水溶性盐、有效磷、水解性氮呈正相关，与其他环境因子呈负相关；Ascomycota与全磷呈负相关，与其他环境因子呈正相关；Basidio-mycota与有机质呈正相关，与其他环境因子呈负相关。

3讨论

3.1不同消毒方式对土壤理化性质的影响

本研究表明，用棉隆和石灰氮对特殊药材连作土壤进行消毒处理后，土壤有机质含量显著增加，这与前人在番茄、草莓等作物中的研究结果相一致：石灰氮处理后，土壤全氮和水解性氮含量均显著提高，这与付宽宽等在芹菜连作障碍中的研究结果相一致：石灰氮消毒和石灰氮配施微生物菌剂处理后，土壤速效钾含量显著提高，棉隆和石灰氮分别配施微生物菌剂处理后土壤有效磷含量显著增加，这与杨馥霞等在草莓上的研究结果存在差异，原因可能是由于棉隆和石灰氮使用剂量的差异所致。

3.2不同消毒方式对土壤酶活的影响

土壤酶可以介导有机物的分解代谢，是农业生态系统中控制土壤碳和养分循环与固定的关键因素，是衡量土壤健康状况的重要指标。其中，脲酶专门催化尿素水解释放氨和二氧化碳，其活性可以表征土壤氮素的状况；过氧化氢酶可以分解土壤中的过氧化氢，使作物避免受其毒害：蔗糖酶可以将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，促进土壤有机质的转化：磷酸酶可催化土壤有机磷化合物矿化，是衡量土壤有机磷分解转化的重要指标。本研究结果表明，与CK相比，棉隆处理和棉隆配施微生物菌剂处理显著降低土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性，这与运翠霞等的研究结果一致：石灰氮配施微生物菌剂和微生物菌剂处理显著提高了土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性，表明补充生物菌剂可以提高土壤酶活性：石灰氮和石灰氮配施微生物菌剂处理显著增加土壤脲酶活性，这与土壤速效钾、全氮、水解性氮含量较高的结果相一致，且Pearson相关性分析也表明土壤脲酶活性与速效钾、全氮、水解性氮均呈显著正相关：石灰氮配施微生物菌剂处理显著增加土壤蔗糖酶活性，这与全氮含量较高的结果相一致，且Pearson相关性分析也表明土壤蔗糖酶活性与全氮呈显著正相关。

3.3不同消毒方式对土壤微生物多样性和群落结构的影响

本研究表明，不同消毒方式处理的土壤细菌Chaol、Ace和Shannon指数均显著高于对照，表明土壤消毒剂和消毒剂配施微生物菌剂处理可显著提高土壤细菌丰富度与多样性，这与前人在烟草、凤头姜中的研究结果一致；棉隆和石灰氮分别配施微生物菌剂和微生物菌剂单独处理的土壤，其真菌Chaol、Ace、Simpson指数均显著高于对照组，表明微生物菌剂处理和土壤消毒剂配施微生物菌剂处理可以显著提高土壤真菌丰富度与多样性，这与张庆华等在草莓中的研究结果一致。

本研究中，不同消毒处理土壤细菌群落优势菌门为变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门等。变形菌门属于有益菌群，且不同消毒处理（T1、T2、T3、T4）提高了其相对丰度，说明土壤消毒或消毒剂配施微生物菌剂可以提高土壤中有益菌的比例：除石灰氮处理外，不同消毒处理均降低了酸杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度。不同处理土壤细菌群落优势菌属为鞘氨醇单胞菌属、WD2101-soil-group、RB41等，石灰氮和石灰氮配施微生物菌剂处理显著提高了鞘氨醇单胞菌属的相对丰度。鞘氨醇单胞菌属具有降解污染物的功能，表明石灰氮和石灰氮配施微生物菌剂处理显著改善了土壤环境。不同消毒处理均提高了马赛菌属的相对丰度，马赛菌属具有改良土壤、修复重金属污染、溶磷等功能，表明对土壤进行消毒处理可以增加有益菌属的丰度，改善土壤微生态环境。

本研究中，不同处理土壤真菌群落优势菌门为子囊菌门、接合菌门、担子菌门，这与张春怡等在土壤消毒结合菌剂对茄子根际土壤真菌群落变化的研究结果一致。子囊菌门有利于树叶、木屑等有机物的分解，在各处理中相对丰度大小顺序为：T3>T5>T4>CK>T2>T1;不同处理均显著降低了接合菌门的相对丰度：除石灰氮配施微生物菌剂处理外，不同处理均提高了有益菌群担子菌门的相对丰度。不同消毒处理土壤真菌的优势菌属为被孢霉属、亡革菌属和链格孢属。不同处理均可显著降低土壤被孢霉属的相对丰度，这与朱诗君等在土壤消毒对草莓土壤真菌群落变化上的研究结果一致：棉隆和棉隆配施微生物菌剂处理显著降低了镰刀菌属的相对丰度，镰刀菌属是重要的植物病原菌之一，可以引起多种植物病害，如禾谷镰刀菌与玉米穗腐病有关，尖孢镰刀菌可引发番茄、黄瓜等作物枯萎病。

3.4环境因子对根际土壤微生物群落的影响

本研究结果表明，土壤细菌群落主要受pH值、有效磷、水溶性盐、全氮、水解性氮的影响；土壤真菌群落主要受水解性氮、有机质、pH值、全氮、速效钾的影响。酸杆菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、粘球菌门与pH值、全氮、水解性氮呈正相关。这表明土壤养分的变化可能影响根际土壤的微生态环境，使土壤中有益微生物增加，pH值、全氮、水解性氮等理化性质的改变是影响消毒后特种药材连作土壤微生物群落变化的重要因素。

4结论

本研究结果表明，不同消毒方式处理一定程度上改善了土壤理化性质，石灰氮配施微生物菌剂处理显著提高了土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性。不同消毒处理均可显著提高土壤细菌丰富度与多样性，棉隆配施微生物菌剂、石灰氮和石灰氮配施微生物菌剂处理可以显著提高土壤真菌丰富度与多样性。石灰氮和石灰氮配施微生物菌剂处理显著提高了有益菌群鞘氨醇单胞菌属的相对丰度，不同消毒处理均提高了有益菌群马赛菌属的相对丰度，且均降低了被孢霉属的相对丰度，棉隆和棉隆配施微生物菌剂处理显著降低了致病菌群镰刀菌属的相对丰度。pH值、全氮、水解性氮等理化性狀的改变是影响消毒后特种药材连作土壤微生物群落变化的重要因素。综上所述，不同消毒方式处理在一定程度上改善了土壤养分供应，并引起根际土壤细菌和真菌群落的变化，研究结果可为进一步阐明特殊药材连作障碍发生机理提供理论基础。