自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的生长和致病

董在芳，丁腾腾，单艺轩，李洪连，陈琳琳，邢小萍

河南农业大学植物保护学院/小麦玉米作物学国家重点实验室，郑州 450002

0 引言

【 研究意义】 假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病在世界范围内广泛发生，对全球粮食生产安全造成严重威胁[1-2]。在中国，该病作为一种新发病害，蔓延迅速，逐年加重，目前在黄淮麦区、西北麦区及长江中下游麦区均有发生，病害导致小麦年平均减产9%—35%，发生较重区域小麦减产可达70%以上[3-5]。2022 年中国科协将“小麦茎基腐病近年为什么会在我国小麦主产区暴发成灾，如何进行科学有效地防控？”列为10 个产业技术问题之一[6]，说明解决小麦茎基腐病在小麦生产中的发生危害已迫在眉睫。对假禾谷镰孢致病分子机制认识不足制约了小麦茎基腐病防控策略的制定，因此解析假禾谷镰孢致病机制对小麦茎基腐病的科学防控具有实践意义。【前人研究进展】自噬是生物体非常保守的一种降解途径，蛋白、质膜和细胞器等有机物质包裹在双层膜的自噬体中，与溶酶体或内质网融合后降解，并为新大分子合成提供原料和能量，进而维持细胞代谢平衡和度过不良环境[7-8]。细胞自噬由一系列保守的自噬相关蛋白（autophagy-related protein，Atg）调控发生。以模式植物病原真菌稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）为例，当真菌暴露在逆境环境（营养匮乏和氧化胁迫等）或雷帕霉素处理后，Atg13去磷酸化，与 Atg17 结合，激活 Atg1，并形成Atg1-Atg13-Atg17 复合体调控自噬的起始。PI3K 激酶复合体（包括Atg6、Atg14、Vps34 和Vps15）诱导细胞自噬的合成以及下游Atg 的招募[9-11]。Atg8-磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）泛素系统和Atg12-Atg5-Atg16 泛素系统在自噬体形成和扩张中起关键作用，泛素活化酶（E1）Atg7 和泛素结合酶（E2）Atg3 参与调控Atg8-PE 共轭的形成[12-13]。自噬与植物病原真菌的生长、发育、侵染及对胁迫环境的响应密切相关[14-15]。在稻瘟病菌中，MoAtg8、MoAtg9和MoVast1等自噬相关基因在附着胞的形成中起关键作用，进而影响病原菌的致病性[16-19]。利用遗传转化方法对禾谷镰孢（Fusariumgraminearum）的28 个Atg分别进行敲除，发现∆Fgatg1和∆Fgatg3等18 个Atg突变体的菌丝生长减慢，∆Fgatg1和∆Fgatg5等11 个突变体的孢子产生具有明显缺陷，除∆Fgatg17，其他所有突变体引起小麦赤霉病的能力明显减弱[20]。【本研究切入点】前期在假禾谷镰孢中鉴定到29 个保守的Atg，转录组数据分析发现多个基因在侵染阶段诱导表达[21]，但自噬在假禾谷镰孢中的功能尚不明确。近期研究发现假禾谷镰孢菌丝融合关键调控因子FpHam-2和FpHam-3 与FpAtg3 直接互作，FpHam-2缺失突变体自噬的发生明显受阻[22]，猜测FpAtg3 可能在自噬调控的菌丝融合中起作用。Atg3 在真核生物中非常保守，且只有一种类型，能与Atg7、Atg8、Atg12 和磷脂膜相互作用，调控自噬体的形成[23-24]。虽然在Atg系列敲除突变体中测定了∆Fgatg3在禾谷镰孢生长、产孢和致病性中的表型[20]，但对植物病原镰孢菌Atg3的功能缺乏系统的分析。自噬相关基因FpAtg3在假禾谷镰孢中的功能有待明确。【拟解决的关键问题】通过遗传转化和生物学表型分析，探讨FpAtg3 的功能，为进一步揭示细胞自噬在假禾谷镰孢致病过程中的作用和调控机制提供参考。

1 材料与方法

试验于2022 年5 月至2023 年9 月在河南农业大学植物保护学院粮食作物病虫害监测与防控创新实验室完成。

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 假禾谷镰孢野生型菌株Wz2-8 由河南农业大学植物保护学院粮食作物病虫害监测与防控创新团队分离并保存[4]。

1.1.2 供试植物 高感假禾谷镰孢Wz2-8 的小麦品种矮抗58 由国家小麦工程技术研究中心提供种子，并由河南农业大学植物保护学院粮食作物病虫害监测与防控创新团队扩繁、留种，啤酒大麦种子购于河北兴农富民种子销售有限公司。

1.2 方法

1.2.1 真菌Atg3 同源蛋白进化树的构建 在NCBI网站下载真菌酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、构巢曲霉（Aspergillusnidulans）、粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）、稻瘟病菌、禾谷镰孢、尖镰孢（Fusariumoxysporum）、灰霉菌（Botrytiscinerea）、胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）的Atg3氨基酸序列，与假禾谷镰孢的 FpAtg3，利用MEGA5.05 软件的邻接法构建系统发育树，bootstrap值设置为1 000。

1.2.2FpAtg3基因缺失及回补突变体的获得 参考赵静雅等[25]的方法，用Split-PCR 的方法构建FpAtg3基因敲除盒，所用引物列于表1。整个过程包括3 轮PCR 扩增，简述如下：第1 轮PCR 扩增将获得目标基因FpAtg3的上游（A1）和下游（A2）约1 000 bp 的DNA 序列，该过程以假禾谷镰孢Wz2-8 菌丝体的基因组DNA 为模板，分别以F1+R1 和F2+R2 为引物，另外，以包含潮霉素抗性基因的pKOV21 质粒为模板，以HYG/F+HYG/R 为引物经PCR 扩增获得潮霉素基因（H）。第2 轮PCR 扩增将获得A1-H-A2 的融合片段，用作第3 轮PCR 的模板，该步骤的PCR 反应体系包括模板（A1∶A2∶H=1∶1∶3 质量比）、10×LA Taq buffer 5 µL、dNTPs 2 µL、LA Taq 0.2 μL、ddH2O补足50 µL，不加任何引物，PCR 反应条件为94 ℃ 5 min 预变性，94 ℃ 30 s 和58 ℃ 30 s，15 个循环，72 ℃3.5 min 再延伸。第3 轮PCR 扩增将获得A1 和潮霉素上游融合的片段及潮霉素下游与A2 的融合片段，以第2 轮PCR 扩增的产物为模板，分别以F1+HY/R 和YG/F+R1 为引物。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

参考WANG 等[26]的方法，利用PEG 介导的假禾谷镰孢原生质体转化方法，将A1H1 和H2A2 同时导入假禾谷镰孢Wz2-8 的原生质体中，并利用含有潮霉素的PDA 平板筛选阳性转化子。利用PCR 检测含有潮霉素基因、FpAtg3上游和潮霉素的融合片段、FpAtg3下游和潮霉素的融合片段，同时不含FpAtg3的转化子为FpAtg3被潮霉素替换的菌株。利用PCR扩增FpAtg3基因全长及其上游约1.5 kb 的启动子序列，全长2 900 bp，使用诺唯赞一步克隆试剂盒将其构建到pKNTG 载体上。所用引物列于表1。利用PEG介导的原生质体转化将pKNTG-FpAtg3重组质粒导入FpAtg3缺失突变体（ΔFpAtg3）中，经G418 抗性筛选和PCR 检测获得FpAtg3回补（FpAtg3-C）菌株。

1.2.3 菌丝生长和产孢测定 将待测假禾谷镰孢菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上活化，用直径5 mm 的打孔器在菌落边缘取菌饼，分别转接到含有15 mL PDA、完全培养基（CM）和基础培养基（MM）的平板（直径9 cm）上，25 ℃避光培养3 d，测量菌落直径、观察菌落形态并拍照。在无菌试管中倒入3 mL PDA 培养基，将新鲜的假禾谷镰孢菌丝块接种到试管中，25 ℃避光培养3 d，观察气生菌丝量并拍照。假禾谷镰孢菌丝块转接到PDA 平板上，并在菌饼两侧放置两个无菌盖玻片，25 ℃避光培养，当菌丝长至盖玻片2/3 处时取出盖玻片，放置在载玻片上，用显微镜观察菌丝形态并拍照。

在250 mL 三角瓶中加入50 mL 无菌的CMC 培养液，放入用打孔器（直径5 mm）在菌落边缘取的两块菌饼，放置在摇床内，25 ℃、150 r/min 培养5 d。用单层miracloth 滤布过滤并收集分生孢子，显微镜观察分生孢子的形态及分隔数，血球计数板计数并计算孢子浓度。试验至少重复3 次，每次试验每组样品设置3 个技术重复。

1.2.4 菌丝融合率和孢子融合芽管率测定 无菌的载玻片蘸取融化好的PDA 培养基，将菌丝块接种在载玻片上，放置在培养皿中保湿。约培养24 h，至菌丝在载玻片上蔓延，在显微镜下观察菌丝形态及菌丝融合。每组数20 根菌丝，记录发生融合的菌丝数，每菌株数5 组，试验重复3 次。

参照VANGALIS 等[27]的方法计算孢子融合芽管调控的融合率。在直径6 cm 的培养皿底部放盖玻片，倒入5 mL 皮氏培养基，凝固成平板。收集的分生孢子调节浓度至106个孢子/mL，随后转移到皮氏培养基平板上，25 ℃、黑暗培养12 h。在显微镜下观察孢子融合芽管，每组数50 个融合芽管，每菌株数5 组，试验重复3 次。

1.2.5 致病力测定 小麦胚芽鞘接种：矮抗58 小麦种子在保湿的培养皿中，25 ℃避光培养2 d，随后将催芽后的小麦转移到带土培养钵中，在温室环境下（25℃、16 h 光照∶8 h 黑暗）生长3 d，将小麦苗拔出、备用。用直径5 mm 的打孔器取活化的待测假禾谷镰孢的菌丝块，接种到小麦胚芽鞘中间部位，25 ℃、避光、保湿培养24 h，去掉菌饼并将接种的小麦转移到温室条件下继续培养2 d，观察小麦发病、测量病斑长度并拍照。

大麦叶片接种：啤酒大麦在25 ℃、黑暗条件下催芽2 d，随后种在带土的培养砵中，温室环境下培养4 d，取叶片备用。用直径5 mm 的打孔器取活化的待测假禾谷镰孢的菌丝块，每个叶片接两个菌饼，25 ℃、避光、保湿培养24 h 后，去掉菌饼，并将接种的大麦叶片转移到温室条件下继续培养2 d，测量病斑长度并拍照。试验至少重复3 次，每次试验每组样品设置5个重复。

盆栽试验：将100 g 小米在沸水中煮90 s，捞出、晾干后装入100 mL 三角瓶中，在灭菌锅中121 ℃、20 min 灭菌，分别接入3 块活化的假禾谷镰孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株的菌丝块，25 ℃、避光培养约5 d，期间每隔24 h 手动混匀小米培养基，至菌丝布满小米粒，取出晾干，与无菌土混合制备质量比为0.5%的菌土，备用。不接菌的小米作为空白对照。在每个培养钵中底部放150 g 无菌土，每钵种6 粒催芽的小麦种子，上面覆50 g 菌土，浇足水后，置于25℃、16 h 光照∶8 h 黑暗条件下培养 9 d，观察小麦生长、计算小麦茎基腐病病情指数，并拍照，每组处理设置4 个重复。

1.2.6 耐受性测定 将活化的假禾谷镰孢待测菌株，用直径5 mm 的打孔器取菌落边缘菌丝块，分别转接到含0.2 g·L-1刚果红（CR）、0.025% SDS 或10 mmol·L-1H2O2的PDA 平板上，无添加的PDA 平板为空白对照。试验重复3 次，每次试验每组样品设置5 个重复。

1.3 数据处理与分析

采用T 测验统计分析样品间的显著性差异，数据表示为平均值±标准差，Excel 软件绘制柱形图。

2 结果

2.1 FpAtg3 系统进化分析

在NCBI 网站上下载酿酒酵母等3 种模式真菌以及禾谷镰孢等5种常见植物病原真菌的Atg3氨基酸序列，与假禾谷镰孢FpAtg3 构建系统进化树。如图1显示，Atg3 在丝状真菌中比较保守，且Atg3 在进化上符合物种进化的方向，比如假禾谷镰孢FpAtg3 与禾谷镰孢FgAtg3 亲缘关系最近，其次为尖镰孢和其他丝状真菌的Atg3，与单细胞真菌酿酒酵母的ScAtg3亲缘关系较远。

图1 Atg3 蛋白进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of Atg3 proteins

2.2 FpAtg3 缺失突变体的获得

利用潮霉素抗性筛选阳性转化子，经PCR 检测获得 3 株FpAtg3被潮霉素基因置换掉的菌株（ΔFpAtg3），如图2-A 所示，在其基因组中能检测到750 bp 的潮霉素抗性基因片段（H）、1 518 bp 的FpAtg3上游-潮霉素融合片段（F）以及1 368 bp 的潮霉素-FpAtg3下游融合片段（R），无FpAtg3，对照野生型菌株的基因组 DNA 中能检测到 329 bp 的FpAtg3，无潮霉素抗性基因。利用PEG 介导的原生质体转化将pKNTG-FpAtg3导入ΔFpAtg3-T1 菌株中，利用PCR 可检测652 bp 的FpAtg3，由此获得ΔFpAtg3的回补菌株（FpAtg3-C）（图2-B）。

2.3 FpAtg3 参与假禾谷镰孢的生长和产孢

将活化的假禾谷镰孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株，分别转接到PDA、CM 和MM 培养基上，25 ℃避光培养3 d。与野生型和FpAtg3-C 菌株相比，ΔFpAtg3在3 种营养培养基上的生长均明显减慢，色素积累和菌落形态无显著差异（图3-A、3-C），ΔFpAtg3在PDA 培养基上的气生菌丝减少（图3-B）。显微观察发现，在PDA 培养基上生长24 h，ΔFpAtg3与假禾谷镰孢野生型和FpAtg3-C 菌株的菌丝形态也有明显差异，ΔFpAtg3的菌丝呈波纹状卷曲（图4）。

图3 假禾谷镰孢菌丝生长测定Fig. 3 Hyphal growth assays of F. pseudograminearum

图4 菌丝和孢子形态Fig. 4 Hyphal and conidial morphology

将活化的假禾谷镰孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株，转接到CMC 培养液中诱导分生孢子的产生。结果显示，与野生型和FpAtg3-C 菌株相比，ΔFpAtg3分生孢子的产量下降了约50%（表2），且分生孢子变短、分隔减少（图4、表2）。综上，FpAtg3参与假禾谷镰孢的菌丝生长，影响菌丝形态、产孢及孢子形态。

表2 假禾谷镰孢不同菌株的孢子量、隔膜数、菌丝融合率和孢子融合芽管率Table 2 Conidiation, septa per conidium, hyphal fusion rate and CAT-mediated fusion rate of different F. pseudograminearum strains

2.4 FpAtg3 参与假禾谷镰孢的菌丝融合及孢子融合芽管调控的融合

活化后的假禾谷镰孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株在PDA 平板上培养24 h，显微观察发现，野生型和FpAtg3-C 菌株的菌丝融合非常普遍，与之相比ΔFpAtg3的菌丝融合率明显降低。孢子融合芽管是另一种类型的细胞融合，与菌丝融合结果相一致，ΔFpAtg3孢子萌发芽管调控的融合与野生型相比也明显减少，FpAtg3-C 的孢子融合芽管率可恢复到野生型的水平（表2）。综上，FpAtg3 参与假禾谷镰孢菌丝融合及孢子融合芽管调控的细胞融合。

2.5 FpAtg3 的缺失影响假禾谷镰孢的致病力

假禾谷镰孢野生型和FpAtg3-C 菌株表现强致病力，在大麦叶片和小麦胚芽鞘上均能侵染并形成明显扩展的坏死病斑，而ΔFpAtg3在大麦叶片和小麦胚芽鞘上的病斑长度明显变短（图5-A、5-B）。

图5 致病力测定Fig. 5 Pathogenicity determination

利用盆栽试验进一步验证接种各菌株在小麦苗期茎基腐病的发生情况。结果显示，野生型和FpAtg3-C 菌株接种的小麦，植株生长减慢，根茎部变褐坏死（图6-A、6-B），小麦茎基腐病病情指数达76.2（图6-C）。在相同条件下，ΔFpAtg3接种的小麦，植株生长较空白对照（CK）略有减慢，小麦茎基腐病发生明显减轻（图6-A、6-B），病情指数为14.3（图6-C）。以上结果说明FpAtg3参与假禾谷镰孢对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根茎部的致病。

图6 盆栽试验Fig. 6 Pot-culture experiments

2.6 FpAtg3 的缺失影响假禾谷镰孢对非生物胁迫的耐受力

植物病原真菌对非生物胁迫的敏感性会影响致病力，因此检测了假禾谷镰孢野生型、ΔFpAtg3和FpAtg3-C 菌株对细胞壁、细胞膜和氧化胁迫的耐受性。将活化的各菌株分别转接至含有0.2 g·L-1刚果红、0.025% SDS 或10 mmol·L-1H2O2的PDA 平板上，25℃、避光培养3 d。结果显示，在上述非生物胁迫条件下，所有菌株的生长均受到明显抑制，与野生型和FpAtg3-C 菌株相比，刚果红、SDS 和H2O2对ΔFpAtg3菌丝生长的抑制率均明显提高（图7-A、7-B）。说明FpAtg3 参与假禾谷镰孢对细胞壁、细胞膜和氧化胁迫的耐受性。

图7 假禾谷镰孢对非生物胁迫的耐受力测定Fig. 7 Abiotic stress response assays of F. pseudograminearum

3 讨论

3.1 自噬在植物病原真菌中的作用

自噬是细胞内一种重要的降解途径，在真菌的生理和致病过程中均起重要作用。镰孢菌包含多种动物和植物的病原菌，比如引起小麦赤霉病的禾谷镰孢，利用遗传学方法对其27 个Atg分别进行敲除，多个Atg缺失突变体的生长、产孢和致病性表现异常[20,28]。在轮枝镰孢（Fusariumverticillioides）中，自噬相关蛋白FvAtg4 和FvAtg8 直接互作，基因缺失后病原菌不能发生细胞自噬，突变体的菌丝生长、色素沉着、产孢和致病性等表型具有明显缺陷，伏马毒素B1 的合成明显降低[29]。假禾谷镰孢与禾谷镰孢在形态结构和遗传进化等方面非常相似，曾被认为是同一种真菌，但随着研究的深入，越来越多的证据表明两者在多个方面表现差异，包括有性生殖方式、寄主组织偏好性和侵染特点等[2,30]。在前期研究中发现，STRIPAK 复合体的核心元件FpHam-2/-3/-4 是假禾谷镰孢菌丝融合的关键作用因子，并参与病原菌的产孢和致病。通过酵母双杂交筛选发现FpHam-2 和FpHam-3 与自噬相关蛋白FpAtg3、FpAtg28 和FpAtg33 均直接互作，且FpHam-2缺失突变体在饥饿条件下细胞自噬的发生明显受阻[22]。菌丝融合是子囊类真菌中普遍存在的一种生理现象，包括细胞质、细胞器的融合，以及细胞核的降解[31-32]。在尖镰孢中，自噬体形成的核心调控基因FoAtg8缺失后，细胞自噬缺陷除影响病原菌的生长、产孢和致病性以外，突变体的菌丝融合率降至野生型的10%[33]。由此，猜测除Atg8 还有其他自噬相关蛋白作用于自噬调控的菌丝融合。

3.2 自噬相关基因Atg3 的功能

Atg3 编码E2 泛素结合酶，其同源蛋白在哺乳动物、昆虫、植物和真菌中普遍存在，且只有一种类型，能与Atg7、Atg8、Atg12 和质膜等结合，对自噬体的形成起关键调控作用[34-35]。分别在哺乳动物小鼠和模式真菌酿酒酵母中敲除Atg3，均抑制机体细胞自噬的发生，并由此引发一系列依赖自噬调控的生理缺陷[22,35]。近期研究发现，Atg3 在不依赖细胞自噬的生理过程中也起重要调控作用，比如DNA 损伤诱导的有丝分裂[24,36]。在植物病原真菌中，对Atg3 的关注和研究报道相对较少。在稻瘟病菌中，发现MoAtg3 与组蛋白乙酰转移酶MoHat1 直接互作，并且MoHat1乙酰化MoAtg3，进一步影响MoAtg3 与MoAtg8 之间的结合，从而抑制病原菌的细胞自噬及致病性[37]。在镰孢菌中，虽有报道Atg3 与病原菌的产孢和致病有关，但缺乏对Atg3 功能的系统分析，尤其是Atg3 在丝状真菌菌丝融合中的作用尚不明确。

本研究利用真菌遗传转化在假禾谷镰孢中将FpAtg3敲除后，与野生型菌株相比，FpAtg3缺失突变体表现出菌丝生长减慢、形态异常、产孢量减少、孢子分隔减少、菌丝融合率和孢子融合芽管率明显降低等一系列生理缺陷；此外FpAtg3缺失突变体的致病力及对非氧化胁迫的耐受力也明显减弱。丰富了自噬在植物病原真菌中的功能研究，可为揭示基于自噬调控的假禾谷镰孢的致病机理并进一步防控小麦茎基腐病提供理论依据。

4 结论

自噬相关基因FpAtg3在丝状真菌中非常保守，遗传分析表明FpAtg3 调控假禾谷镰孢的菌丝生长、产孢、细胞融合、致病力以及对非生物胁迫的耐受性，研究结果可为探究细胞自噬在假禾谷镰孢致病过程中的作用及调控机制提供参考。