UPLC-MS/MS测定羊奶和羊奶粉中安乃近残留量

2024-03-19 12:31李璐杨家秀王聪董文君张艳
食品工业 2024年2期
关键词:安替比林羊奶粉安乃近

李璐,杨家秀,王聪,董文君,张艳*

1.富平县检验检测中心 (陕西省羊乳产品质量监督检验中心)(富平 711700);2.陕西圣唐乳业有限公司 (富平711700)

安乃近(metamizole sodium),是氨基比林和亚硫酸钠的络合物,属于吡唑酮类的非甾体类解热镇痛抗炎药,通过抑制前列腺素(PG)合成酶(环氧酶,COX-1、COX-2和COX-3),减少前列腺素合成而发挥药效[1]。人因个体差异或不当使用会引起严重的不良反应,如皮疹、坏死性肠炎、再生障碍性贫血、肝肾功能异常、过敏性休克等[1],美国、澳大利亚、日本等30多个国家已禁用或限用该药。2020年我国停止安乃近注射液等品种的使用[2],修订安乃近片对妊娠晚期妇女和18岁以下青少年儿童禁用[3]。安乃近是兽医临床常用的治疗药物,对大型家畜的使用产生的不良反应通常不被人们重视。肌肉给药24 h后,牛奶中残留标志物4-甲基氨基安替比林浓度占总残留的比例为27%[1],羊奶中代谢残留研究尚未见诸报道。国家要求食品动物的休药期为28日,禁奶期为7日[4],准确检测安乃近的残留量成为市场监管的必然要求。国家标准中规定安乃近在羊奶中的最大残留限量为50 μg/kg[5],与欧盟标准的规定相同[6],羊奶粉根据出粉率折算成羊奶进行判定。

安乃近的检测方法有分光光度法[7]、流动注射化学发光光度法[8]、薄层色谱法[9]、液相色谱法[10]、液相色谱-质谱联用法等[11],其中超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)技术有助于降低内源性物质的干扰[12],适用于痕量药物残留的测定[13]。羊奶与牛奶的营养素构成和维生素、矿物质含量存在明显差异[14],所以亟须建立针对羊奶和羊奶粉中安乃近残留量的检测方法,对日常风险监测及地理标志产品的保护均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine,纯度≥ 99.1%)、4-乙酰氨基安替比林(4-acetylaminbantipyrine,纯度≥99.9%)、4-甲基氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine,纯度≥99.9%):天津阿尔塔科技有限公司;4-甲酰氨基安替比林(4-formylaminoantipyrine,纯度≥99.9%,坛墨质检科技股份有限公司);4-异丙基氨基安替比林-D6(4-isopropylantipyrine-D6,纯度≥99.9%,北京曼哈格生物科技有限公司);甲酸、乙酸铵、异丙醇(色谱纯,阿拉丁试剂有限公司);甲醇、乙酸、乙腈(色谱纯,德国默克公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris,分析纯,天津市光复精细化工研究所);羊奶和羊奶粉(陕西圣唐乳业有限公司)。

超高效液相色谱-质谱联用仪1290-G6460C(配ESI离子源,美国安捷伦公司);BEH C18色谱柱(柱长50 mm,柱内径2.1 mm,填料粒径1.8 μm,美国安捷伦公司);MTN-5800A-24氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);H20-I-1-UV-T超纯水机(德国赛多利斯集团)。

1.2 试验方法

1.2.1 液相洗脱条件和质谱条件的选择

分离条件以GB/T 22971—2008《牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[15]为基础,依据仪器条件和色谱柱的不同进行调整,使4个组分能充分被识别。

1.2.2 样品制备方式的选择

按照提取、浓缩的步骤制备试样,以回收率和精密度考察方法的准确性。回收率的计算参考GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[16]中附录F的F.1,精密度参考F.3。

1.2.3 定量限的测定

在羊奶和羊奶粉中添加目标化合物,做平行样,测基线噪音值,依据特征离子色谱峰rSN>10为方法定量限[16],测定方法的定量限。

2 结果与分析

2.1 液相洗脱条件和质谱条件优化

2.1.1 色谱条件

色谱柱C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱温40 ℃;流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为0.1%甲酸乙腈;梯度洗脱:0~4.0 min、90%~75% A,4.0~6.0 min、75%~70% A,6.0~10.0 min、70%~90% A;流速0.25 mL/min;进样量2 μL。

2.1.2 质谱条件

电离方式ESI+;雾化器压力35 Psi;毛细管电压2 500 V;干燥气温度325 ℃;干燥气流速12 L/min;多反应监测(MRM)模式。化合物的其他参数见表1。

表1 各组分质谱分析参数

有机相采用甲醇时,由于第1个峰出峰早,所以出现肩峰现象,更换有机相为乙腈后峰形完好,调整使用乙腈作为有机相。当使用0.1%甲酸时,室温下流动相的pH约2.5,并且同加入乙酸铵和乙酸时峰形和峰面积差异不显著,所以不使用乙酸铵和乙酸作为流动相,也避免盐类对质谱可能造成的损害。优化洗脱梯度后(见2.1.1),4个组分得到有效识别,浓度约100μg/L时的结果见图1。

图1 总离子流图及定量多反应监测结果

2.2 提取条件的优化

为避免羊奶中含有大量的小分子蛋白质等物质的干扰,采用增大乙腈加入量进行提取,并且减少提取次数至1次,避免多次提取时小分子化合物使溶液浑浊,以减少基质效应产生的不良影响,也简化了提取步骤,提高了提取效率。

2.3 样品制备

称取5.00 g羊奶,置于50 mL带刻度的聚丙烯离心管中,加入50 μL 1.0 mg/L内标工作溶液、0.5 mL 1.0 mol/L的Tris溶液及20 mL乙腈,涡旋混合1 min,振荡提取15 min,于4 ℃,5 000 r/min离心5 min,上清液转移至25 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,混匀,作为提取液。取5.0 mL提取液至10 mL玻璃刻度管中,加入5.0 mL异丙醇,混匀,于40 ℃氮吹至近干,加入1.0 mL初始流动相溶解,混匀后过0.22 μm滤膜,供超高效液相色谱-串联质谱测定。

称取12.5 g羊奶粉于100 mL烧杯中,加适量水(35~50 ℃)溶解,冷却后加水至总质量100 g,混匀,按照上述羊奶的步骤处理。

2.4 内标量的优化

4-甲基氨基安替比林的测定采用4-异丙基氨基安替比林-D6作为同位素内标。选定内标化合物之后,关键在于确定合适的内标浓度[17]。内标浓度太大,前处理时损失的内标量也多,出于经济节约考虑,在能够满足测定需求的前提下,内标的上机浓度选为最低浓度10 μg/L。

2.5 线性范围、线性方程和定量限

吸取约0,50,250,500,1 000,2 000和5 000 μL 0.2 mg/L混合标准液及100 μL 1.0 mg/L内标工作溶液,用空白基质溶液定容至10 mL容量瓶中,得到基质混合标准系列溶液,现用现配。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林采用外标法定量,4-甲基氨基安替比林以4-异丙基氨基安替比林-D6作为内标采用内标法定量。以峰面积(或与内标峰面积的比值)(y)为纵坐标,标准品质量浓度(x)为横坐标,进行线性回归拟合,各组分回归方程结果如表2所示。相关系数R2>0.995,线性关系良好,符合要求。

表2 4种组分的线性方程、相关系数

按照定量限的测定方法,离子色谱峰rSN>10,测定定量限。4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林的定量限分别为2.8,3.9,0.088和1.4 μg/kg。

2.6 重复性

在羊奶和羊奶粉样品中分别添加约5和40 μg/kg的标准品进行重复性试验,每个添加水平重复6次,计算变异系数(C.V.),结果见表3。变异系数为0.3%~ 2.0%,符合要求。

表3 羊奶和羊奶粉中安乃近的重复性(n=6)

2.7 回收率和精密度

在样品基质中添加4个水平(羊奶约5,10,20和50 μg/kg;羊奶粉约40,80,160和400 μg/kg)的标准品进行加标回收试验,计算回收率,每个添加水平重复6次,结果见表4。结果表明,4个组分的回收率为83.6%~100.2%,相对标准偏差(SRSD)为0.3%~ 6.5%,方法的回收率和精密度能够满足定量分析要求,结果准确可靠。回收率按式(1)计算。

表4 羊奶和羊奶粉中安乃近的回收率和精密度(n=6)

回收率=(测得值-本底值)/添加量×100%(1)

2.8 样品检测结果

随机抽取市场上3份样品同质控样品一并按照上述建立的超高效液相色谱-质谱联用法进行检测,结果见表5。抽取的羊奶样品均没超过国家标准中规定的安乃近的最大残留限量50 μg/kg。一般情况下羊奶粉的出粉率约12.5%,安乃近的最大残留限量折算成羊奶粉约400 μg/kg,抽取的羊奶粉样品也没超过该值。并且质控样品测得值准确可靠,这3份样品中安乃近残留量远不会对人体产生伤害作用。

3 结论

羊奶和羊奶粉复溶后加入Tris溶液,采用乙腈沉淀蛋白并提取安乃近残留物,等量加入异丙醇促进氮吹浓缩的方式,建立一种超高效液相色谱-质谱联用技术同时测定4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林残留量的方法。该方法前处理操作简单,节约试剂耗材,用时短,既灵敏又准确,具有一定优越性,能够很好地测定羊奶和羊奶粉中安乃近残留量,可用于日常风险监测,提高市场监管水平。

猜你喜欢
安替比林羊奶粉安乃近
水质挥发酚测定中4-氨基安替比林提纯方法的改进
警惕隐身的“安乃近们”
安乃近的风风雨雨
2问安乃近
测定生活污水和工业废水中挥发酚时的体会
退烧药安乃近已被许多国家禁用或限用
羊奶粉产业规模快速扩大
关于直接法测定挥发酚中4—氨基安替比林提纯的探讨
HPLC法测定米格来宁片中安替比林与咖啡因的含量
羊奶粉“掺牛” 不“纯粹”