丹东草莓根腐病病原菌鉴定及生物学特性研究

陈晓旭郑亚娟王作英王应玲赵睿杰那明慧

(1.丹东农业科学院,辽宁 凤城 118100; 2.辽宁省玉米育种重点实验室,辽宁 凤城 118100; 3.凌源市沟门子镇人民政府,辽宁 凌源 122000)

辽宁丹东是全国最大的草莓生产和出口基地,“丹东草莓”获国家农产品地理标志保护,现品牌价值达77.5 亿元,位居全国第一[1]。 由于草莓种植区土壤连作情况严重,重茬地增多导致草莓根腐病发生逐年加重,是制约丹东草莓发展的重要因素之一[2]。 虽有研究表明,引起草莓根腐病的主要病原菌包括立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、草莓疫霉(Strawberryphytophthora)及大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)等20 余种土传病原真菌,但目前丹东地区草莓根腐病致病菌种类尚未报道[3～7]。因此,准确鉴定引起丹东地区草莓根腐病的致原菌,对该病害的防治及抗病育种工作具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试草莓病株采集于2021 年丹东东港、丹东凤城等地草莓种植基地,共采集10 份。

1.2 致病菌的分离纯化

采用常规组织分离法进行致病菌的分离:使用无菌水对病样进行清洗晾干后,对发病部位横切0.5 cm 小段,取病健交界处纵向切薄块,75%酒精消毒30 s,无菌水洗涤2 次,1%次氯酸钠浸泡3 min,无菌水洗涤3 次,无菌干燥滤纸吸干病样表面的水分。 置于PDA 平板28 ℃倒置培养。

纯化:待分离平板长出菌落后,取菌落边缘新生菌丝置新的PDA 平板上进行培养,反复进行操作,直至平板菌落一致,分离菌株纯化完毕。

1.3 分离菌株致病性测定

使用干热灭菌处理的基质盆栽培养脱毒草莓苗,分离菌株使用PD 培养基28 ℃、150 r/min 培养5～7 d,菌液打碎稀释后对健康草莓植株进行接种。

接种:上述菌液稀释至含孢子5×107个/ml以备接种,使用注射器针头对健康草莓苗根部做伤口处理,取菌液5 ～10 ml 浇灌在茎附近土壤表面,保湿培养。 接种无菌水做为对照处理,每处理接种5 株草莓苗。

1.4 病原菌的形态学鉴定

采用魏景超的真菌鉴定方法对病原菌进行形态学鉴定,将病原菌平板4 ℃处理7 d 后,室温放置30 min,挑取少量菌丝悬浮于滴加无菌水的载玻片上,用高倍镜观察病原菌分生孢子形态。 从病原菌的菌丝、菌丝分枝、孢子等形态特征来进行分类鉴定。

1.5 病原菌的分子生物学鉴定

取适量纯化的病原菌菌丝,采用CTAB 法提取菌丝基因组DNA。 借助真菌ITS 区域通用引物(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和镰刀菌延伸因子-1α 蛋白(elongation factor 1α,EF-1α)特异性 引 物 ( TEF1-αF: 5 ’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’; TEF1-αR: 5 ’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’)对分离菌株的ITS 序列和TEF-1α 序列进行扩增,扩增产物送由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。 测序结果经NCBI 数据库进行同源性比对。 选取与病原菌EF-1α 序列同源性高的菌株序列,利用MEGA 4.0 软件构建系统进化树。

1.6 生物学特性研究

1.6.1 温度 依据实际棚内环境分别设置5、10、15、20、25、30、35 ℃共7 个温度梯度,采用PDA 平板培养致病菌株,每处理重复5 次。 十字交叉法测量菌落直径,并进行统计分析。

1.6.2 不同pH 值 依据实际棚内土壤pH 值设置5、6、7、8、9 共5 个pH 梯度,用盐酸和氢氧化钠调节培养基酸碱度,配制成不同pH 值的培养基,制成平板25 ℃下恒温培养致病菌株,每处理重复5 次。 十字交叉法测量菌落直径,并进行统计分析。

1.6.3 光照 设置3 种处理:24 h 全光照、24 h全黑暗、12 h 光照12 h 黑暗。 采用PDA 平板培养致病菌株,每处理重复5 次。 十字交叉法测量菌落直径,并进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 田间发病症状

2021 年在丹东凤城地区、东港地区通过草莓病害调查发现,发病植株叶片枯黄萎蔫,根系表面呈黑色,侧根不定根少或无,茎基部横切,可见中心至边缘处呈赤褐色。

2.2 病原菌形态学鉴定

分离纯化得到14 株菌株,形态学鉴定为同一种菌株,命名为SRR-1,菌落呈圆形、气生菌丝白色绒状、边缘整齐、轮状向外扩展,菌落背面呈深黄色至浅黄色。 镜检下小型分生孢子数量较多,大多为卵形或者肾形,单孢,假头状着生于分生孢子梗上;大型分生孢子为马特形,两端钝圆,顶孢稍弯,有隔膜,多为2 ～3 个隔;分生孢子梗为瓶状,细长。 根据菌株形态学特征,参考Booth《镰刀菌属》分类系统进行鉴定,初步将SRR-1 鉴定为茄腐镰刀菌。

图1 草莓根腐病田间症状

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

提取病原菌DNA,采用真菌ITS 区域通用引物ITS1、ITS4 扩增获得一条600 bp 左右的片段,基因测序后经BLAST 比对发现,该病原菌属于镰刀菌属。 使用镰刀菌通用测序引物TEF1-αF/TEF1-αR 扩增获得一条700 bp 左右的片段,基因测序后经BLAST 比对显示该病原菌与茄腐镰刀菌F.solani相似度达100%。 基于TEF1-α 序列构建发育树。

2.4 草莓根腐病病原菌的致病性

健康草莓植株接种病原菌,14 d 左右草莓叶片边缘出现萎蔫,叶尖干枯,茎秆持续变红,植株活力不足,21～48 h 后整株萎蔫,与田间症状表现一致,取根部冲洗,发现侧根、须根变少变黑。 茎基部纵切发现黑褐色。 依据柯赫氏法则再次分离菌株与接种的病原菌一致,表明茄腐镰刀菌为草莓根腐病致病菌。

2.5 温度对菌丝生长的影响

丹东地区温室草莓一般9 月初左右定植,持续到次年4 ～5 月,棚内温度基本在10 ～30 ℃之间。 因此,将接种好的菌落平板分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒温培养箱培养。 结果表明病原菌菌丝生长最适宜温度在25 ～30 ℃。 低于15 ℃或高于35 ℃菌丝生长较慢(图5)。

图2 草莓根腐病致病菌的菌落形态、菌丝和分生孢子

图3 基于ITS 序列构建的发育树

图4 草莓根腐病致病菌的致病性

图5 温度对菌丝生长速率的影响

2.6 pH 对菌丝生长的影响

将病原菌接种于不同pH 的培养基中28 ℃恒温培养,结果表明pH 5～8 之间,菌丝均能正常生长(图6)。

图6 pH 值对菌丝生长速率的影响

2.7 光照条件对菌丝生长的影响

草莓根腐病致病菌株SRR-1 在24 h 黑暗条件下生长最快,其次是光暗交替环境下,菌落直径分别为7.78 cm 和7.73 cm。 全光照下生长最慢,菌落直径为7.47 cm(图7)。

图7 光照对菌丝生长速率的影响

3 结论与讨论

本研究通过对丹东地区草莓根腐病病株采样,经组织分离得到菌株14 株,形态学鉴定为同一种菌株,柯赫式法则验证为草莓根腐病致病菌,通过形态学和分子生物学等技术流程,鉴定该菌株为茄腐镰刀菌;生物学特性研究表明:茄腐镰刀菌菌丝生长适宜温度在25～30 ℃、最适宜酸碱度在pH 5～8、24 h 黑暗条件下菌丝生长速率最快。

草莓根腐病在国内外有不同程度的研究报道,引起草莓根腐病的主要病原菌包括立枯丝核菌(R.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)等20 余种土传病原真菌,从而导致草莓根腐病药剂防治效果不明显。 本研究鉴定了茄腐镰刀菌可引起草莓根腐病的发生,为丹东地区草莓根腐病防治提供有力依据。 茄腐镰刀菌在西班牙被鉴定为引起草莓等几种作物根腐病的病原菌[8～9],重庆地区茅苍术根腐病的主要病原菌是茄腐镰刀菌[10],茄腐镰刀菌可以在土壤中长期存活从而增加病害侵染的风险。 丹东地区草莓根腐病的主要致病菌是茄腐镰刀菌,是否存在其他致病菌种类,还有待进一步分离鉴定。 针对草莓根腐病病原菌茄腐镰刀菌的高效防治药剂筛选有待进一步研究。 在草莓栽培过程中,要加强田间管理,合理调控温湿度及土壤酸碱度,及时清理病株枯叶,病害高发期选用广谱型药剂做好预防工作。