乳酸菌发酵中药对大鼠痛风症状的影响研究

陈 妍 李市场杜莹瑞 胡锋阳 丁 慧 龚明贵

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471000）

痛风是最常见的炎症性关节炎之一[1]，高尿酸血症是痛风发生的主要因素[2]。痛风发作可引起常见的肾脏疾病等并发症[3]。家禽痛风是一种蛋白质代谢障碍引起的高尿酸血症，其病理特征为血液尿酸水平增高，尿酸盐在关节囊、关节软骨、内脏、肾小管及输尿管中沉积。赵运吉[4]对高蛋白饲料引起的雏鹅痛风进行研究，发现通过掺拌粗饲料、减少日粮供应量、多喂青饲料等方法降低日粮蛋白质含量可以减少尿酸的产生。

白杨素是一种天然存在于蜂蜜、蜂胶和蘑菇中的类黄酮化合物。Chang等[5]研究发现，白杨素具有抗高尿酸和抗炎作用，可以辅助治疗痛风。本文研究的中药发酵液的原料含有车前草、土茯苓、桑叶等药材。单纯的中药发酵风味差，为改善中药本身苦涩的口感，可添加少量的果蔬（如柠檬、柚子、猕猴桃、马齿苋等）作为辅料，自然发酵。本试验研究中药发酵液对痛风性关节炎大鼠血清指标以及肾脏、踝关节相关指标的改善效果，探究其作用机制，为中药发酵液在动物生产中应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 中药发酵液

中药发酵液由洛阳糠豪川禾科技有限公司提供（发酵用优势菌种为戊糖乳杆菌和美洲虎乳杆菌，将马齿苋、苦荞等干燥研磨过80目筛混合作为底物，液体厌氧发酵180 d）。

1.1.2 试验动物

雄性大鼠60只，雄性，SPF级，体重（200±20）g，购自河南科技大学基础医学院（试验动物许可证明编号：SYXK（豫）2020-0008）。

1.1.3 试验试剂

1,1-二硝基-2-三硝基苯肼、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，购自默克化工技术（上海）有限公司；维生素C、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、邻苯三酚，购自天津市德恩化学试剂有限公司；AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒，购自上海易汇生物科技有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器与设备

高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；HH-S4型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；SW-CJ-2D型双人净化工作台（苏州净化设备有限公司）；BCD-318AT 型卧式冷冻箱（海尔电器有限公司）、生化培养箱（太仓精宏仪器设备有限公司）、ME203E/02 型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）、iMagic-V7型全自动生化分析仪（深圳市库贝尔生物科技股份有限公司）。

1.2 发酵液成分分析

样品从-80 ℃冰箱中取出解冻后，涡旋10 s混匀。取混匀后的样本200 μL，置2 mL离心管，加入200 μL提取剂提取。涡旋5 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。取上清液用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，于进样瓶中保存，委托嘉兴迈维代谢生物科技有限公司进行HPLC-MS/MS检测，并由该公司协助进行数据分析。

HPLC-MS 条件：色谱柱，Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流动相，A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B 相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脱梯度，0 min B 相比例为5%，9.00 min 内B 相比例线性增加至95%，并维持在95% 1.00 min，10.00～11.10 min，B 相比例降为5%，并以5%平衡至14.00 min；柱温40 ℃；流速0.35 mL/min；进样量4 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）温度550 ℃，质谱电压5 500 V （正模式）/-4 500 V （负模式），帘气（CUR）25 psi，碰撞诱导电离（CAD）参数设置为高。在三重四级杆（QQQ）中，每个离子对根据优化的去簇电压（DP）和碰撞能（CE）进行扫描检测。

1.3 急性毒性试验

从河南科技大学医学院购买大鼠30 只（雄性）随机分成3 组，分别灌胃低浓度（20%）发酵液、中浓度（40%） 发酵液、 高浓度（60%） 发酵液16 mL/kg，在每天灌胃1 次的情况下，持续灌胃15 d，观察试验大鼠均无不良反应，表明发酵液无毒性可进行后续试验。

1.4 试验设计

选择60只雄性大鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、发酵液低浓度组、发酵液中浓度组、发酵液高浓度组。所有大鼠自由进食和饮水，适应性喂养3 d后开始试验。空白对照组给予正常大鼠饲料，其余组大鼠均给予2%氧嗪酸钾联合12%酵母膏饲料，连续造模4周。阳性对照组（别嘌醇片组：浓度为0.52 g/L）、发酵液低浓度（20%）组、发酵液中浓度（40%）组、发酵液高浓度组（60%）组大鼠灌胃16 mL/kg 对应浓度的发酵液，空白对照组和模型对照组大鼠灌胃相应体积的生理盐水。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 样品采集

试验结束后用戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 000 r/min 离心15 min 得到血清。取肾脏、踝关节，用4 ℃的生理盐水冲洗，洗尽残血，以4%甲醛固定。

1.5.2 肾脏指数、踝关节周径

使用卷尺紧贴大鼠踝部最细处，水平环绕一周，记录测量结果，即踝关节周径。甲醛固定的样本进行石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色，供常规光镜下切片的病理形态学变化观察，计算肾脏指数。

1.5.3 血清生化指标

取适量存放于EP 管中处理后的大鼠血清，血清中尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量按试剂盒说明书进行测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用Word 和Graphpadprism8 作图，SPSS统计软件进行单因素方差分析，采用t检验比较组间差异显著性。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 中药发酵液成分分析

利用软件Analyst1.6.3处理质谱数据，得到混样样品质谱分析总离子流，见图1。

图1 混样样品质谱分析总离子流

中药发酵液成分分析见表1。

表1 中药发酵液成分分析

由表1可知，中药材发酵液中主要含有9种物质，其中含有黄酮类化合物55种，相对含量占15.39%。

2.2 不同浓度发酵液对大鼠踝关节周径的影响（见表2）

由表2 可知，治疗后高浓度发酵液组大鼠踝关节周径与空白对照组最为接近，极显著低于模型对照组（P＜0.01），说明高浓度发酵液能够有效改善大鼠踝关节痛风症状。

2.3 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠肾脏指数的影响（见图2）

图2 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠肾脏指数的影响

由于尿酸盐通过肾脏，会加大肾脏的负荷。尿酸盐在肾脏沉积，肾脏萎缩，导致肾脏受损质量减轻，肾功能衰退。由图2 可知，发酵液能够明显抑制这种趋势，高浓度发酵液组大鼠的肾脏系数与空白对照组最为接近，作用效果最明显。高浓度发酵液组肾脏指数高于模型对照组，极显著低于空白对照组（P＜0.01）。

2.4 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清UA 含量的影响（见图3）

图3 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清UA含量的影响

UA产生过多与肾损害有关，是引发高尿酸血症的关键因素，而高尿酸血症是痛风发生的重要生理生化基础。由于UA过高会造成尿酸盐沉积，本研究通过测定大鼠血清UA含量判断发酵液改善痛风性关节炎的效果。

由图3 可知，与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清UA含量极显著升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，高浓度发酵液组大鼠血清UA含量极显著降低（P＜0.01）。结果表明，高浓度发酵液能够有效降低大鼠体内UA含量。

2.5 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清BUN含量的影响（见图4）

图4 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清BUN含量的影响

BUN能够反映肾组织健康程度，肾损伤会伴随BUN增加。由图4 可知，与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清BUN含量极显著升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，高浓度发酵液组大鼠血清BUN 含量极显著降低（P＜0.01）。高浓度发酵液组大鼠血清BUN 含量明显低于其他组，表明高浓度发酵液可降低血清BUN含量，保护肾损伤。

2.6 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清Cr含量的影响（见图5）

图5 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清Cr含量的影响

Cr 是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。肾脏损害伴随着BUN 和血Cr 的增加[6-9]。由图5 可知，与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清Cr含量显著升高（P＜0.05）；与模型对照组相比，高浓度发酵液组大鼠血清Cr含量显著降低（P＜0.05），表明高浓度发酵液能够降低大鼠血清Cr含量，减少肾损伤。

2.7 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清IL-1β 含量的影响（见图6）

图6 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清IL-1β含量的影响

痛风性关节炎大鼠足肿胀程度与炎症因子[10]有关。由图6 可知，与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清IL-1β 含量极显著升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，高浓度发酵液组大鼠血清IL-1β含量显著降低（P＜0.05）。结果表明，高浓度发酵液能够抑制炎性因子表达，减轻水肿及炎性细胞浸润，缓解痛风性关节炎的炎症症状。

2.8 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清TNF-α含量的影响（见图7）

图7 不同浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠血清TNF-α含量的影响

尿酸钠结晶刺激局部组织产生大量炎性细胞因子，如TNF-α，其含量升高说明体内存在炎症反应。由图7可知，与空白对照组相比，模型对照组大鼠血清TNF-α含量极显著升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，高浓度发酵液组血清TNF-α含量极显著降低（P＜0.01）。结果表明，高浓度发酵液能够有效终止炎性细胞因子的活化，改善痛风性关节炎大鼠炎症情况。

2.9 不同处理组大鼠肾脏损伤病理切片（见图8）

由图8可知，空白对照组肾色暗红，表面光滑，外观无肿胀，肾小管结构清晰，肾组织形态正常。模型对照组肾色暗黄，肾脏组织被膜不完整，肾小球萎缩，肾小管排列紊乱，大部分细胞点状坏死，肾脏受损严重。阳性对照组肾脏病变明显减轻，肾小管仍见扩张，管腔增大。低浓度发酵液组肾小管排列紊乱，局部细胞点状坏死。中浓度发酵液组肾脏病变程度减轻，肾脏组织被膜较完整，个别细胞坏死。高浓度发酵液组肾组织炎性细胞浸润明显减轻，肾小管扩张和间质纤维化有所改善，与空白对照组肾脏状态最为接近[11-13]。

结果表明，中药材发酵液可在一定程度上改善肾损伤的病理学状况，缓解损伤肾组织的炎症，减轻炎性细胞浸润，其中以高浓度发酵液对痛风性关节炎大鼠的改善效果最显著。

2.10 不同处理组大鼠踝关节病理切片（见图9）

图9 不同处理组大鼠踝关节病理切片（100×）

由图9 可知，空白对照组大鼠踝关节滑膜组织形态、组织结构正常，无炎性细胞浸润，无组织水肿现象[14]。模型对照组大鼠踝关节滑膜肿胀表层受损，细胞可见明显增生，结构排列紊乱，并伴有大量炎性细胞浸润。阳性对照组轻微滑膜细胞增生、变性，炎细胞减少。低浓度发酵液组和中浓度发酵液组大鼠踝关节滑膜组织轻度肿胀，细胞轻度增生，结构排列紊乱。高浓度发酵液组大鼠踝关节滑膜组织轻度肿胀，细胞排列稍显紊乱，与空白对照组状态接近。

3 讨论

3.1 中药发酵液对大鼠肾功能的影响

中草药经乳酸菌发酵后活性物质含量增加，大分子物质分解转化为小分子物质。血清UA、BUN 和Cr 含量是反映肾脏功能的特异性指标。UA 是由肾脏排出体外，BUN 和Cr 是蛋白质的代谢产物，经肾脏排出。本研究中，模型对照组大鼠血清UA、BUN 和Cr 含量均明显高于空白对照组，说明肾功能出现了问题。高浓度发酵液组大鼠血清UA、BUN 和Cr 含量均低于模型对照组，且与空白对照组接近，说明该中药发酵液对肾功能损害大鼠的肾脏具有一定的保护作用。

3.2 中药发酵液对大鼠血清IL-1β含量的影响

白细胞介素是一类具有多重功效的细胞因子，可由多种细胞产生，在炎症的发生发展中起到重要作用。本研究中，模型对照组大鼠血清IL-1β 含量高于空白对照组，高浓度发酵液组显著低于模型对照组，说明中药发酵液能够抑制IL-1β 炎性因子的表达，降低炎症指标，减轻水肿及炎性细胞浸润，缓解痛风性关节炎大鼠的炎症症状。

3.3 中药发酵液对大鼠血清TNF-α含量的影响

TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生，是痛风性关节炎炎症反应急剧发生发展的重要介质，对炎症介质的抑制是有效减轻痛风炎症的手段。本研究中，模型对照组大鼠血清TNF-α含量明显高于空白对照组；与模型对照组相比，中药发酵液低浓度组对TNF-α含量改善效果不明显，高浓度组明显降低，表明中药发酵液对痛风性关节炎大鼠模型具有一定的抗炎和防治作用。

3.4 中药发酵液改善痛风性关节炎作用机制探讨

中药发酵液中营养物质和其他生物活性物质含量丰富，包括所用原料自身所有成分与微生物发酵转化后产生的新成分。微生物发酵可提高许多生物活性物质含量。类黄酮是植物次生代谢产物，来自许多水果、蔬菜、和其他植物性食物[15]。发酵液中的功效性物质包括黄酮、酚类、矿物质、功能性低聚糖、酶及其他次生代谢产物等。作为重要的中药成分，黄酮生物活性广泛[16-17]。本研究结果显示，与模型组相比，高浓度发酵液组大鼠血清中UA 和BUN 含量极显著降低，说明高浓度发酵液能够通过抑制黄嘌呤氧化酶（XOD）活性保护由UA 过高造成的肾损伤，对改善痛风症状具有良好的作用。

中医治疗痛风具有多成分、多靶点、综合调节的特点，具有较大的临床应用前景[18]。近年来，相关学者针对中医药治疗痛风开展了大量动物试验研究，并取得了一定成效。翟福展[19]通过不同可饲用天然植物组方对痛风鸡蛋的临床表现、血清变化进行综合评价，发现由积雪草、车前子、益母草、五加皮组成的方剂效果最为显著。研究表明，以赤苍藤、甘草、姜黄、薏仁作为防治家禽痛风病的组方，使用12 种益生菌对中药进行发酵，肉鸡痛风治愈率达82.00%[20]。本文以2%氧嗪酸钾联合12%酵母膏特殊饲料进行造模得到痛风动物模型，试验结果显示，中草药发酵液可改善痛风动物的肾损伤。中药发酵营养成分含量丰富，能够降低血清UA含量，各种原料相互促进、协同增效，使其具备预防和调理痛风的功效。本试验条件下，车前草、山楂、马齿苋等配伍使用对2%氧嗪酸钾联合12%酵母膏特殊饲料饲养的高尿酸血症大鼠具有积极的影响。因此，乳酸菌发酵中药辅以果蔬治疗痛风具有广阔的开发前景，值得进一步深入开发[21-23]。

4 结论

本研究结果表明，中药发酵液对由高UA引起的肾损伤具有一定保护作用，对痛风性关节炎大鼠具有一定的消炎作用，以高浓度效果最为明显。