两种重金属联合胁迫下斑马鱼的规避行为变化

李秀麟，赵志伟，李星权，毕鑫琪，梁志杰，刘国臣

(1. 中国人民解放军陆军勤务学院军事设施系，重庆 401331；2. 重庆大学环境与生态学院，三峡库区生态环境教育部重点试验室，重庆 400044)

近年来，水环境污染问题日益严峻，水污染事故频发引起了国内外对水质安全的高度重视[1]。其中，重金属是目前水体中最常见的污染物之一，具有危害高、治理难等特点[2]。因此，如何快速、准确监测水体重金属污染并对其进行科学评价，成为当今环境科学关心的热点问题。相较于以往的理化分析手段，生物毒性分析具有方便简易、灵敏度高和监测时间短等优点，能够快速准确地监测和预警水质突发性污染。

生物监测与预警系统以水生生物对污染物的生理行为响应为基础，通过实时连续监测受试生物行为反映水质变化[3]。目前，鱼类生物常常被用于水质污染物的监测，其试验结果大多数情况也适用于人类。生物及其生存环境是统一整体，当外界环境发生变化时，生物适应性的表现方式首先为行为改变，而其行为变化的程度及对污染水体的不同反应为水质污染监测提供了基本数据支撑。通常情况下，水体环境常常受到多种污染物联合作用，水生生物与水体中的污染物直接接触[4]，其行为数据的变化表征为多种化合物的联合毒性。

目前，鱼类生物监测与预警系统主要有深圳RTB、德国BBE、中国科学院的BEWs，均是通过高清摄像头对鱼类的游动行为进行捕捉，通过轨迹分析软件对其运动行为指标(游动速度、加速度等)与群体行为指标(分散度、平均距离等)进行量化分析，其结果受外界非毒性因素(噪声、光照)影响较大，且耗时较长。鱼类的规避行为是鱼类的自发性行为反应，当受到污染物刺激后，会自动前往无污染或污染程度较低的区域，其受外界因素影响较低。

本研究以2种重金属(Zn2+、Cd2+)联合胁迫下斑马鱼的规避行为变化为基础，考察2种重金属联合胁迫下对斑马鱼游动速度与距中心对角线距离的影响，研究在水质突发性污染情况下多种污染物的联合毒性对水生生物的行为响应变化，为水质监测预警模型的建立提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

(1)试验生物：斑马鱼，购于沙坪坝花鸟鱼市场，分批次购买，每批次的斑马鱼数量需满足3组试验的试验用量，健壮无病，体型一致，无畸形；斑马鱼体长为(4±1)cm，在实验室中饲养7 d，当死亡率低于5%时，方可用于试验[5]；定期更换饲养箱中的水，通过持续曝气，保证饲养箱中水体的含氧量≥6 mg/L；每天对鱼类进行投食，并清理饲养箱中的粪便和残存的饵料，试验前24 h停止喂食；光照周期为10 h∶14 h。

(2)化学试剂：氯化锌(ZnCl2、分析纯、阿拉丁)，氯化镉(CdCl2、分析纯、阿拉丁)。

(3)试验仪器：鱼类规避行为预警装置，若达思(EthoVision XT)操作系统，溶解氧测定仪，80 L水箱(2个)，烧杯(2 L)、玻璃棒、容量瓶等玻璃器皿，分析天平，温度控制装置。

1.2 试验设计

采用60 min流水暴露试验，测定斑马鱼在不同毒性浓度氯化镉、氯化锌中的行为毒性响应。在流水试验中，污染物的配置浓度以24 h的半致死剂量为一个毒性单位，即1 TU。试验分别在不同污染物浓度(毒性单位)不同比例(10∶0、3∶7、5∶5、7∶3、0∶10)下进行，其中，氯化镉、氯化锌的LC50-24 h分别为 6.69、40.8 mg/L[6]。

在联合污染物的暴露试验中，试验用水使用充分曝气的自来水。试验分别记录在0.1、0.5、1、2 TU浓度下斑马鱼的游动行为变化，记录每分钟的平均值，试验条件与实验室斑马鱼培养条件一致，试验过程中不予投加食物。该试验进行时长为1 h，前30 min为无污染物暴露下的空白试验，后30 min为污染物暴露下的对照试验(因无法避免个体差异，如果选用不同的斑马鱼做对照试验，将影响试验的准确性)。

毒性试验采用持续曝气的自来水配液，且所设置的毒性浓度指配置时的浓度，而非进入监测装置中的1个变化浓度。该暴露试验是一个60 min的流水暴露试验，每组试验8条斑马鱼，流量设置为15 L/h，避免对斑马鱼的游动造成较大冲击。水温通过温度控制装置调节为(26±1)℃，背景光照恒定不变，为实验室灯光。同时，试验过程中尽量控制，减少人为、噪音等客观因素的影响。若达思软件通过摄像头以10～12帧/s保存监测图片，为能够更方便地展示鱼类行为的变化，监测结果以8条鱼每分钟的平均值为有效值，总计60个有效值。各数值的表现方式为平均数±标准误差(mean±SEM)。

试验过程中，为了明确斑马鱼规避行为的变化，采用距中心对角线距离与游动速度来反映其行为变化，试验装置设计图及实物如图1、图2所示，距中心对角线距离分析如图3所示。由于摄像头的视角以及区域划分中存在不可避免的误差，认为当中心管距离在20 cm以上时，鱼类已进入胁迫逃离区。在此过程中，游动速度出现变化的时间(T1)的判断标准：变化前5 min的平均值与变化后5 min的平均值的相对差值在20 %以上[7]；距中心对角线距离出现变化的时间(T2)的判断标准：变化后每分钟的距离平均值在15 cm以下的占比在20%以下。

图1 装置设计图Fig.1 Design Drawing of the Device

图2 装置实物图Fig.2 Physical Map of the Device

图3 距中心对角线距离分析图Fig.3 Analysis Chart of Diagonal Distance from the Center

2 结果与分析

氯化锌与氯化镉联合作用下，斑马鱼的游动速度与距中心对角线的距离变化如图4～图8所示。在对照组中，其游动速度与距中心对角线的距离波动不大，游动速度相对稳定，距中心对角线距离基本稳定在10～15 cm。在试验组中，游动速度呈现先上升后下降的趋势，距中心对角线距离呈现逐渐增大而后稳定的趋势，最终稳定在21 cm左右，可视为基本进入胁迫逃离区。

2.1 联合暴露下游动速度的变化分析

在0.1、0.5、1、2 TU的浓度暴露下，其游动速度出现变化的时间(T1)如表1所示，基本稳定在(12±1.0)、(8.4±1.1)、(4.6±0.89)、(1.6±0.54)min。斑马鱼在接触污染物后，其游动速度均呈现先上升后下降的趋势，试验组与对照组的游动速度比值如表2所示。相同比例条件下，在0.1～2 TU的浓度暴露下，游动速度比值呈现先增大后降低的趋势；在0.1～1 TU的浓度暴露下，游动速度最终稳定在对照组平均水平。斑马鱼逐渐调整行为机制，适应污染环境，通过调节机体的代谢和生理机能而逐步适应，使鱼体达到一个新的平衡状态[8]。在2 TU暴露下，游动速度在对照组平均水平停留短暂时间后继续下降，可能是因为在高浓度毒性暴露下，斑马鱼的行为机制受损，无法适应高浓度暴露环境，只能通过降低其行为活动和新陈代谢来减少与污染物的接触[9]。

表1 游动速度变化时间Tab.1 Time Change of Swimming Speed

通过SPSS20.0软件对试验组与对照组的30个游动速度数据进行差异性分析，如表3所示。结果表明：在0.1～1 TU的浓度暴露下，试验组与对照组的差异显著性随浓度的升高而增大；在0.1 TU暴露下，对照组与试验组呈现显著性差异(p<0.05)，其中，Zn2+∶Cd2+=3∶7时达到极显著性差异(p<0.01)；在1 TU和2 TU暴露下，对照组与试验组则已呈现十分显著的差异(p<0.001)。

表2 Zn2+与Cd2+联合作用下试验组与对照组行为 指标比值Tab.2 Comparison of Behavior Indicators Ratio between Experimental Group and Control Group under the combination of Zinc Ion and Cadmium Ion

表3 污染物暴露下对照组与试验组的行为指标差异性分析Tab.3 Differences Analysis in Behavioral Indexes of Control and Experimental Groups under Pollutant Exposure

注：(a)0.1 TU毒性浓度；(b)0.5 TU毒性浓度；(c)1 TU毒性浓度；(d)2 TU毒性浓度图4 Zn2+∶Cd2+=10∶0下斑马鱼行为的变化Fig.4 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 10∶0

注：(a)0.1 TU毒性浓度；(b)0.5 TU毒性浓度；(c)1 TU毒性浓度；(d)2 TU毒性浓度图5 Zn2+∶Cd2+=7∶3下斑马鱼行为的变化Fig.5 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 7∶3

注：(a)0.1 TU毒性浓度；(b)0.5 TU毒性浓度；(c)1 TU毒性浓度；(d)2 TU毒性浓度图6 Zn2+∶Cd2+=5∶5下斑马鱼行为变化示意图Fig.6 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 5∶5

注：(a)0.1 TU毒性浓度；(b)0.5 TU毒性浓度；(c)1 TU毒性浓度；(d)2 TU毒性浓度图7 Zn2+∶Cd2+=3∶7下斑马鱼行为变化示意图Fig.7 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 3∶7

注：(a)0.1 TU毒性浓度；(b)0.5 TU毒性浓度；(c)1 TU毒性浓度；(d)2 TU毒性浓度图8 Zn2+∶Cd2+=0∶10下斑马鱼行为变化示意图Fig.8 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 0∶10

在相同毒性浓度不同比例下，对照组与试验组的游动速度比值也存在着差异。由表2可知，在0.1～1 TU暴露、两种重金属联合作用条件下，其游动速度的比值明显高于单一重金属作用，其中，当Zn2+∶Cd2+=3∶7时，比值分别为0.20、0.27、0.33，明显高于同一毒性浓度下其他比例；在2 TU暴露下，游动速度的比值低于单一重金属作用，其中，当Zn2+∶Cd2+=3∶7时，比值为0.14，明显低于同一浓度下其他比例比值。结果表明，锌、镉离子的联合毒性作用对斑马鱼的刺激大于单一重金属作用，其中，当Zn2+∶Cd2+=3∶7时，其对斑马鱼的毒性作用大于其他比例。

注：(a)10∶0；(b)7∶3；(c)5∶5；(d)3∶7；(e)0∶10图9 距中心对角线距离变化率与浓度回归分析Fig.9 Regression Analysis of Change Rates of the Distance from the Center Diagonal and the Concentration

2.2 联合暴露下距中心对角线距离的变化分析

在0.1、0.5、1、2 TU的浓度暴露下，距中心对角线距离出现变化的时间(T2)如表4所示，基本稳定在(13.8±0.84)、(11±0.71)、(6.8±0.84)、(3±0.71)min。斑马鱼在接触污染物后，距中心对角线距离逐渐增大，表明斑马鱼逐渐远离中心污染物扩散管，开始向低毒性浓度的区域靠近；随着暴露时间的延长，斑马鱼距中心污染物扩散管的距离越大，最后全部进入胁迫逃离区，稳定在20～24 cm，表明鱼群完全进入避险逃离区。随着暴露浓度的上升，斑马鱼进入胁迫逃离区的时间越短。黄毅等[10]的研究表明，鱼群在感知到污染物存在后，会自动逃离至污染程度较低或无污染的区域。在鱼类的回避阶段，鱼的机体本身并未受到损伤，而仅仅是一种“有目的性逃跑”行为，这一过程可持续几秒到几个小时[11]，回避反应是多数水生生物体应对水环境污染刺激的第一反应。

表4 距中心对角线距离变化时间Tab.4 Change Time of Diagonal Distance from the Center

通过SPSS20.0软件对试验组与对照组的30个距中心对角线距离数据进行差异性分析，如表3所示。结果表明：在0.1～1 TU的浓度暴露下，试验组与对照组的差异显著性随毒性浓度的升高而增大；其中，在0.1、0.5 TU的浓度暴露下，当Zn2+∶Cd2+=3∶7时，其差异显著性要高于同毒性浓度下的其他比例；在1、2 TU的浓度暴露下，对照组与试验组则已呈现十分显著的差异(p<0.001)。

在相同浓度不同比例下，对照组与试验组的比值也存在极大的差异，其结果分析与游动速度基本一致。锌、镉离子联合作用下对斑马鱼规避行为的刺激大于单一重金属作用。其中，当Zn2+∶Cd2+=3∶7时，其规避行为效应要大于其他比例。对距中心对角线距离的比值与浓度进行回归性分析，结果如图9所示，回归性方程如表5所示。在不同比例下，相关性系数均大于0.9，表现为正相关，表明距中心对角线距离与浓度呈现良好的剂量-效应关系。其中，联合污染物暴露下，其规避行为趋势较单一重金属暴露下更加明显，表明重金属联合作用对斑马鱼的刺激要高于单一重金属作用，其中，当Zn2+∶Cd2+=3∶7时，刺激作用最强。

表5 回归性分析统计Tab.5 Statistics of Regression Analysis

3 结论

(1)在两种重金属联合胁迫下斑马鱼的行为变化试验中，由斑马鱼游动速度的变化可知：低浓度毒性作用下，斑马鱼经历行为刺激、行为调整、行为适应；高浓度毒性作用下，斑马鱼除了经历这3种作用，还会经历行为强度降低。

(2)在两种重金属联合胁迫下斑马鱼的行为变化试验中，随着与污染物接触时间的延长，斑马鱼逐渐远离中心污染物扩散管，最后基本完全进入胁迫逃离区。斑马鱼逃离中心污染物扩散管的行为趋势强度与浓度呈正相关，浓度越高，其逃离趋势越明显，进入胁迫逃离区的时间越短。结果表明，斑马鱼在接触污染物后，会自动逃离至污染物或污染程度较低的区域，且浓度越高，逃离趋势越明显，该行为验证了规避行为试验装置设计的可靠性。

(3)相同毒性浓度不同比例暴露，在锌离子与镉离子联合暴露下，对斑马鱼的刺激作用要强于单一重金属暴露。对试验组与对照组距中心对角线距离的比值进行回归性分析，表明重金属联合作用下规避趋势较单一污染物作用更加明显，锌、镉离子联合作用表现为毒性增大的协同作用。当24 h半致死浓度较高的污染物占据主导地位时，其联合毒性作用更强。