超声波辅助酶法制备北芪菇抽提物及其抗氧化能力研究

秦 楠,郭丽丽,王小敏,孙 健,李杰玉,张芹仙,李冠文,刘 星

(山西中医药大学中药与食品工程学院,山西太原 030619)

北芪菇是一种新型功能食用菌,产自山西省浑源县,结合其74 km2富硒地区的地理资源优势,在平菇中添加黄芪(亦称“北芪”)培育而成。除具有平菇普通营养、功能成分以外,氨基酸、多糖、总黄酮含量显著高于平菇,尤其硒含量较普通平菇提高15%[1]。在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、改善心脑血管疾病、调节免疫,促进胃肠运动、助消化等方面表现出良好的药理作用[2-3]。其中,多糖、黄酮类物质具有优良的抗氧化活性,能够有效缓解氧化压力,对疾病预防和治疗有一定的意义[4-5]。

目前,关于北芪菇抽提物及其黄酮类物质的研究还未见报道,其中粗多糖研究报道亦相对较少。邵伟等[6]利用双孢菇菇柄和残次菇为原料,在40 ℃、pH7.0和1.0% NaCl的条件下经菇体自溶,获得双孢蘑菇抽提物,总氮含量达到6.4 g/100 g，氨基酸态氮可达3.1 g/100 g。曹春蕾等[7]对3种木层孔菌的不同溶剂提取物进行了体外抗氧化活性研究,结果表明不同溶剂提取物都具有清除DPPH自由基、羟自由基的能力。缪成贵等[8]对双孢蘑菇总黄酮抗油脂氧化研究发现,抗氧化性随总黄酮含量增加而提高。

本实验探讨了以纤维素酶酶解北芪菇制备抽提物的工艺条件,并对该抽提物进行了体外抗氧化试验，旨在开发一种集营养、调味及保健于一体的天然物质,可用于复合调味品调配、高品质酱油生产等,作为一种理想的食品添加剂在食品中广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

北芪菇 山西大同浑源县;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 美国Sigma公司;硫酸亚铁、水杨酸、H2O2、稀盐酸、甲醛、乙醇、氢氧化钠、纤维素酶(均为分析纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司；试验用水 蒸馏水。

SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技有限公;DS-1高速组织捣碎机 江苏省金坛市友联仪器研究所;TGL-20B离心机 上海安亭科学仪器厂;TP310酸度计 北京时代新维测控设备有限公司;0-32手持型折光仪 上海勃基仪器仪表有限公司:HH-1恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;HS-12磁力搅拌器 北京金紫光仪器仪表公司;AR323CN电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 北芪菇抽提物制备工艺 将新鲜北芪菇切碎成丁,经过高速组织捣碎机组织匀浆,按一定的水料比混匀,加入一定量纤维素酶,调整pH后放入超声波提取器中提取50 min。95 ℃水浴保温10 min方式灭酶,在4 ℃下5000 r/min离心15 min,取上清液,冷冻干燥,即得北芪菇抽提物。

1.2.2 北芪菇抽提物制备单因素实验 本试验选择水料比、超声时间、超声温度、酶用量、pH进行单因素实验,以氨基态氮含量和可溶性固形物含量为指标,不同因子梯度条件见表1。

表1 单因素水平设计表Table 1 Horizontal design of single factor

1.2.3 响应曲面法试验设计 基于单因素实验结果,选用中心组合试验Box-Behnken设计方案,选取酶用量、超声时间和水料比三个变量,以A、B、C来表示,并以1、0、-1分别代表其变量的水平,按方程x=(X-X0)/ΔX对自变量进行编码,其中,x 表示变量的编码值,X表示变量的真实值,X0表示试验中心点变量的真实值,ΔX表示变量的步长变化,氨基态氮含量Y表示响应值,见表2。

表2 中心组合试验Box-Behnken设计因素和水平编码值Table 2 Independent variables and levels in Box-Behnken

1.2.4 氨基态氮含量和可溶性固形物含量的测定 氨基态氮测定:甲醛滴定法[9];可溶性固形物含量测定:手持式折光仪[10]。

1.2.5 黄酮含量的测定 精密称量10 mg芦丁于50 mL容量瓶中,用60%的乙醇溶解至刻度,得到浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。分别量取1、2、3、4、5 mL的芦丁标准溶液于25 mL的容量瓶中,加入60%乙醇5 mL,精密加5%亚硝酸钠溶液5 mL,放置6 min,加入10%的硝酸铝0.5 mL,放置6 min,加入4%的氢氧化钠5 mL,用60%的乙醇定容,室温放置6 min,于510 nm处测定吸光度。

以浓度C(μg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制芦丁标准曲线。精密称取北芪菇酶法抽提物1.0 g稀释102倍,准确吸取稀释后样品溶液5 mL置于25 mL的容量瓶中,按照上述方法测定吸光度,重复三次,计算北芪菇酶法抽提物中黄酮的含量[11-12]。Y=0.043x+0.0554，R2=0.9993。

1.2.6 抗氧化活性的测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的测定 分别吸取2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液和1 mL质量浓度分别为200、300、400、500、600 mg/mL北芪菇抽提物液于比色管中,混匀,避光静置30 min,于517 nm处测定吸光度A样,用1 mL蒸馏水代替样液测定其吸光度值A空白,以VC作为阳性对照[13]。样品对DPPH的清除率为:DPPH清除率(%)=(A空白-A样)/A空白×100。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除率的测定 ABTS自由基的制备:将7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液混合(1∶0.5,V/V),置室温黑暗条件下放置12～16 h后备用,使用前用无水乙醇稀释至吸光度在734 nm处为0.7±0.02[14]。在同一具塞试管中加入3 mL的ABTS自由基溶液和150 μL北芪菇抽提物,避光反应6 min后于734 nm处测定其吸光度值A样,用无水乙醇代替样品测定A空白。以VC作为阳性对照。

ABTS+·的清除率(%)=(A空-A样)/A空白×100

1.3 数据分析

所有试验数据均使用GraphPad Prism 5和Design-Expert 8.0.6统计软件进行数据处理,运用最小差异显著法(LSD)进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 抽提物工艺单因素实验结果

2.1.1 水料比对制取北芪菇抽提物的影响 由图1可知,随着水料比增大,氨基态氮与固形物含量呈现先升高后下降的趋势,当水料比为10∶1 mL/g时,氨基态氮与固形物含量均达到最大值,水料比对其影响极显著(P<0.01)。当水料比大于10∶1,两者含量明显降低,可能是由于水量增大致使菇水混合液变稀,溶出物减少,进而使氨基态氮收率降低,且固形物含量减少[17]。故选取水料比10∶1 mL/g为宜。

图1 水料比对北芪菇抽提物的影响Fig.1 Effect of ratio of water to material on Astragali mushroom extracts

2.1.2 酶用量对北芪菇抽提物的影响 由图2可知,随酶用量增大,北芪菇抽提物氨基态氮与固形物含量均呈现先增加后减少的趋势。酶用量为0.5%时氨基态氮含量达到最高值,然后含量降低;可溶性固形物含量在酶用量为0.3%时达到最高值,然后缓慢减少,酶用量对其影响极显著(P<0.01)。这是由于随着酶用量的增加,酶与底物接触机会增大,导致内容物从细胞中分离出来使氨基态氮收率与固形物含量上升。而当酶量添加到一定程度时内容物已完全溶出,过量的酶无贡献反而会导致内容物降解致使收率减少,固形物含量下降[18-19]。综合考虑,故选取酶用量0.5%为宜。

图2 酶用量对北芪菇抽提物的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on Astragali mushroom extracts

2.1.3 超声时间对北芪菇抽提物的影响 由图3可知,随着超声时间的延长,北芪菇抽提物氨基态氮与固形物含量呈先升高后降低趋势。40 min时氨基态氮与固形物含量均达到了最大值,当大于40 min后含量都逐渐降低,酶用量对其影响极显著(P<0.01)。由于超声时间越长空化效应越强,氨基态氮损失较大导致收率降低,固形物含量减少[20]。故选取超声时间40 min为宜。

图3 超声时间对制取北芪菇抽提物的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on Astragali mushroom extract

2.1.4 超声温度对北芪菇抽提物的影响 由图4可知,随着超声温度的提高,北芪菇抽提物氨基态氮与固形物含量呈均现出先增大后降低的趋势,40 ℃时氨基态氮与固形物含量都达到最高值。这是由于温度对纤维素酶与内源酶系有较大影响,温度过高会破坏酶活性,导致蛋白质等物质分解不彻底,内容物析出减少,因此造成氨基态氮收率与固形物含量下降[21]。故选取超声温度40 ℃。

图4 超声温度对芪菇抽提物的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on Astragali mushroom extracts

2.1.5 pH对制取北芪菇抽提物的影响 由图5可知,随着pH提高,北芪菇抽提物氨基态氮与固形物含量呈均现出先增大后减小的趋势。pH4时氨基态氮与固形物含量都达到最大值。由于pH影响外源酶与内源酶系的活力,pH过高使酶活受限,导致北芪菇子实体分解不彻底,且内容物析出量降低,因此氨基态氮收率与固形物含量呈下降趋势[22]。故选取pH为4为宜。

图5 pH对制取北芪菇抽提物的影响Fig.5 Effect of pH value on Astragali mushroom extract

2.2 响应面法分析

2.2.1 响应面试验结果及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对表5的试验数据进行过多元回归拟合,获得氨基态氮含量(Y),酶用量(A)、超声时间(B)和水料比(C)的二次多项回归模型为:

Y=0.72+0.036A+0.0058B-0.05C+0.0002AB-0.99AC-0.013BC-0.14A2-0.18B2-0.23C2

从方差分析表4中可知,模型F值为47.60,P值为P<0.0001,达到极显著水平,失拟项P=0.0629>0.05不显著,表明该模型与试验拟合程度高,模型精度高,试验误差小,能够用此回归方程推测抽提物工艺条件对氨基态氮含量的影响。回归方程系数显著性检验结果:水料比(C)的一次项及二次项对响应值的影响极显著(P<0.01),超声时间(B)的二次项极显著(P<0.01),酶用量(A)的一次项显著(P<0.05),二次项极显著(P<0.01),超声时间(B)一次项及交互项均不显著。由F值得出试验各因素影响抽提物中氨基态氮含量的主次顺序为水料比(C)>酶用量(A)>超声时间(B)。

表3 响应面设计方案及试验结果Table 3 Design and test results of response surface

表4 二次回归模型的方差分析结果Table 4 Analysis of variance for each item of developed quadratic regression model

根据模型方程绘制响应面图,分别见图6。其中每个响应面分别代表两个变量在恒定值(取零水平值)下,另外两个独立变量之间的相互作用。

图6 两因素交互作用对氨基态氮含量的影响Fig.6 Interactive effects of extraction parameters on the amino nitrogen content

由图6a所示,当水料比处在中心点时,酶用量在0.3%～0.7%范围内,随着超声时间的延长,氨基态氮含量先升高,当用量达到0.5%后,氨基态氮含量缓慢下降。同样当超声时间在30～50 min范围内,氨基态氮含量先升高,达到最大值后再缓慢下降。由图6b所示,当超声时间处在中心点时,酶用量在0.3%～0.7%范围内,随着水料比的增大,氨基态氮含量先显著升高,达到最大值后再逐渐下降。同样当水料比在5∶1～15∶1 mL/g范围内,随着酶用量增加,氨基态氮含量先急剧增大,达到最大值后陡然下降。由图6c所示,当酶用量处在中心点时,超声时间在30～50 min范围内,随着水料比的增大,氨基态氮含量先缓慢升高,达到最大值后再逐渐下降。同样当水料比在5∶1～15∶1 mL/g范围内,随着超声时间的延长,氨基态氮含量陡然升高,达到最大值后再急剧下降。

2.2.2 验证试验 由Design-Expert软件分析得出北芪菇抽提物制取的最佳条件是:酶用量0.52%、超声时间40 min、水料比12.37∶1 mL/g,理论最佳氨基态氮含量为0.760 mg/mL,黄酮含量6.5%±0.25%。考虑到实际操作的方便性,将北芪菇抽提物的制取条件修正为酶用量0.5%、水料比12∶1 mL/g、超声时间40 min、超声温度40 ℃、pH4。在上述条件下设置三个重复进行验证试验,平均值为(0.765±0.12) mg/mL,与预测值拟合度良好,无显著性差异(P>0.05),表明试验确定的模型条件可以用于预测实际值,此方程有效可靠。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 如图7所示,随着抽提物质量浓度的增大,清除DPPH自由基的能力呈现正相关。当质量浓度为200～400 μg/mL范围内,对DPPH自由基的清除率缓慢增大。当质量浓度大于400 μg/mL时,清除率显著增高,当达到600 μg/mL时,与同质量浓度的VC标准品相比,清除DPPH自由基的能力高于对照。通过方差分析表明,各质量浓度间对DPPH自由基的清除能力的差异显著,在一定质量浓度范围内抽提物与清除能力表现出剂量(质量浓度)-效应关系。

图7 不同浓度抽提物对DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of extracts with different concentrations on DPPH free radical

2.3.2 ABTS+自由基清除率 如图8所示,抽提物对ABTS+自由基的清除能力随质量浓度的增大呈现增大趋势。当质量浓度为200～300 μg/mL时,清除率增幅显著(P<0.05),在300～600 μg/mL时,清除率依然增大,但趋势较平稳,与同质量浓度的VC标准品相比,清除ABTS+自由基的能力低于对照。

图8 不同浓度抽提物对ABTS+自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of extracts with different concentrations on ABTS+ free radical

2.3.3 ·OH清除率 如图9所示,在抽提物质量浓度200～600 mg/mL范围内服从线性分布,抽提物对羟自由基清除率随着其质量浓度的增加而增大,说明抽提物对羟自由基清除力的大小与其质量浓度呈现正相关。与同质量浓度的VC标准品相比,抽提物清除羟自由基能力相对较弱。

图9 不同浓度抽提物对羟自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of extracts with different concentrations on ·OH

3 结论与讨论

北芪菇抽提物富含多种营养与功能成分,结合前期抽提物功能成分测定的结果,对于调节免疫、降血糖或降血脂等其他保健功效有待于进一步研究。